Sommaire

 

I - Objet

II - Recommandations générales

III - Méthodologie

Rédigé par: Date: Signature

Vérifié par : Date : Signature

Approuvé par:  Pour application le Signature

I - Objet

Dans ce document est détaillé le protocole d'identification des cultures de mycobactéries par la technique d'hybridation des acides nucléiques au moyen de sondes spécifiques.

 

II - Recommandations générales

 

Nature des prélèvements biologiques testés

Les kits dont on dispose actuellement étant en nombre limité, les tests d'hybridation sont réservés à l'identification des mycobactéries du complexe tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum et M. microti) et des mycobactéries non tuberculeuses M. kansasii M. gordonae, M. avium, M. intracellulare. La souche isolée provient soit d'une culture récente sur milieu solide ou sur milieu liquide dès que la turbidité est supérieure à 1 Mc Farland ou dès que le GI a atteint 300 dans la méthode Bactec 460. L'efficacité de ce test n'a pas été démontrée pour son utilisation directe sur les prélèvements.

 

Contrôle du matériel utilisé

 - Suivi métrologique des étuves, réfrigérateurs et congélateurs.

- Contrôle des micropipettes.

- Contrôle des enceintes de sécurité microbiologique.

 

Précautions d'hygiène et sécurité

 La manipulation des cultures et les différentes épreuves précédant l'étape d'inactivation doivent être réalisées avec les précautions habituelles nécessaires pour garantir la sécurité des manipulations des mycobactéries. (PR-HS-001 et PR-HS-002).

 

 

Contrôles de Qualité (cf. PR-CQ-002)

 

 

III - Méthodologie

1 - Principe

2 - Mode opératoire

 

 

 1 - Principe

Les tests par hybridation sont basés sur la capacité que possèdent des brins complémentaires d'acides nucléiques de s'apparier de manière spécifique pour former des complexes bicaténaires stables. On utilise une sonde d'ADN monocaténaire conjuguée à un marqueur chimioluminescent, complémentaire de l'ARN ribosomal (ARNr). La sonde d'ADN marquée forme avec l'ARN ribosomal libéré, un hybride ARN /ADN stable. Le réactif de sélection qui est une enzyme nucléasique, capable d'hydrolyser les monobrins d'ADN, ne laissera subsister que les hybrides bicaténaires. Le signal lumineux émis par les hybrides est mesuré par un luminomètre. Un résultat est positif lorsque la valeur obtenue est supérieure ou égale à une valeur seuil. Une valeur inférieure fait considérer le test comme négatif.

On utilise les tests ACCUPROBE pour les mycobactéries suivantes :

 - Accuprobe M. tuberculosis complex M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum et M. microti. Ce test ne différencie pas les espèces du complexe tuberculosis entre elles.

 

- Accuprobe M. avium complex M. avium, M. intracellulare. Ce test ne différencie pas les espèces du complexe aviaire entre elles.

 

- Accuprobe M. avium et Accuprobe M. intracellulare. Ces tests permettent de différencier les espèces du complexe aviaire entre elles.

 

- Accuprobe M. kansasii

 

- Accuprobe M. gordonae

 

 

 2 - Mode opératoire

Se reférer aux fiches techniques du fabricant qui accompagnent le kit. Elles sont jointes en annexes du document.

 

Remarques concernant la préparation des échantillons :

 

A partir d'une culture en flacon Bactec

Pour réaliser le test, il ne faut que le volume de la culture soit suffisant. On exigera que le GI soit supérieur à 300.

 

- A partir d'un flacon 12 B

 . Prendre 1,5 ml du milieu de culture liquide et le placer dans un tube de microcentrifugation. Centrifuger pendant 10 minutes à 9000 - 10000 g.

. Décanter le surnageant, puis remettre le culot en suspension suivant les instructions données par la notice d'utilisation.

 

- A partir d'un flacon 13 A

Le test Accuprobe exige que le sang soit entièrement éliminé. Cela sera réalisé en suivant les procédures décrites ci-dessous :

- Prendre 1 à 1,3 ml de milieu de culture liquide et le placer dans un microtube de centrifugation, ajouter 100 µl d'une solution de lavage (solution d'EDTA 50 mM avec 10 % de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate pH 7.2 ). Fermer le bouchon et bien mélanger. Centrifuger à 9000 - 10000 g pendant 5-7 minutes ou à 3800 g pendant 20 mn.

- Décanter le surnageant, puis remettre le culot en suspension dans 1.0-1.5 ml d'eau stérile, mélanger au vortex jusqu'à ce que le culot soit remis en suspension. Centrifuger à 9000 - 10000 g pendant 5-7 minutes ou à 3800 g pendant 20 mn.

- Décanter le surnageant, puis remettre le culot en suspension suivant les instructions données par la notice d'utilisation.

 

A partir d'une culture en milieu MGIT

Pour que la masse microbienne soit suffisante, on ne réalisera le test que

48 heures après la positivité de la culture.

 - Prendre 1,5 ml du milieu de culture liquide et le placer dans un tube de microcentrifugation. Centrifuger pendant 10 minutes à 9000 - 10000 g.

- Décanter le surnageant, puis remettre le culot en suspension suivant les instructions données par la notice d'utilisation.

 

A partir d'une culture en milieu solide

Prélever à la surface d'un milieu de Lowenstein Jensen ou d'un milieu 7H11 le contenu d'une oese de culture que l'on émulsionne directement dans le tube contenant les réactifs (Lyse - hybridation).