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Contrôle de Qualité |
Rév A |
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Nature de la modification |
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Création |
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Sommaire
I - Objet
III - Documents de référence
IV - Contrôles de Qualité
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La présente procédure a pour objet de déterminer les modalités de contrôle des techniques de Biologie Moléculaire appliquées aux mycobactéries.
Cette procédure doit être associée à la procédure Contrôle de Qualité PR-CQ-001.
Cette procédure s'applique à l'ensemble des biologistes, internes, et techniciens(nes) du laboratoire.
Guide de Bonne Exécution des Analyses. Arrêté du 2 novembre 1994.
a - Contrôles positifsc - Contrôles de contamination du laboratoire
e - Recherche d'inhibiteurs de l'amplification
a - Contrôles positifsLes contrôles positifs permettent de contrôler le déroulement général du test d'amplification et la validité des réactifs utilisés.
AMPLICOR® Roche et LCx Abbott2 types de contrôles positifs :
Contrôle positif d'amplification et de détection
- Le réactif est constitué d'ADN du complexe Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 ou 27294.
- Il est fourni par le fabricant.
- Il contrôle uniquement les étapes d'amplification et de détection.
- Ce contrôle doit être réalisé obligatoirement pour chaque série.
Contrôle positif d'extraction
- Le réactif est constitué d'une suspension bactérienne du complexe Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 ou 27294.
- Il est préparé par l'utilisateur (cf. fiche technique en annexe du document).
- Il contrôle, les étapes d'extraction, d'amplification et de détection.
- Il est recommandé de réaliser régulièrement un contrôle positif d'extraction.
AMTDT Gen-Probe®
1 type de contrôle positif :
- Le réactif est constitué d'une suspension bactérienne du complexe Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 ou 27294.
- Il est préparé par l'utilisateur (cf. fiche technique en annexe du document).
- Il contrôle, les étapes d'extraction, d'amplification et de détection.
- Ce contrôle doit être réalisé obligatoirement pour chaque série.
La positivité du contrôle, (cf. interprétation des résultats en annexe du document) est indispensable pour valider le résultat.
Les contrôles négatifs ont pour but de dépister une éventuelle contamination survenue au cours du test d'amplification.Les causes de contamination sont variées ( réactif, petit matériel ou environnement contaminé, erreur de manipulation ...).
Attention : un résultat négatif obtenu avec les contrôles négatifs n'exclut pas la possibilité d'une contamination isolée d'un échantillon quelconque de la série.
AMPLICOR ® Roche et LCX Abbott
2 types de contrôles négatifs :
Contrôle négatif d'amplification et de détection
- Le réactif est constitué d'ADN autre que celui du complexe Mycobacterium tuberculosis : M. gordonae (ATCC 14470) ou M. terrae (ATCC 15755).
- Il est fourni par le fabricant.
- Il contrôle les étapes d'amplification et de détection pour les 2 tests. De plus pour Amplicor, il permet le contrôle de l'étape d'extraction à partir du moment où sont lysées les bactéries.
- Ce contrôle doit être réalisé obligatoirement, au moins une fois, à chaque série.
Contrôle négatif d'extraction
- Le réactif est constitué d'eau stérile ou d'une suspension bactérienne autre que celle du complexe Mycobacterium tuberculosis, ex: M. gordonae (ATCC 14470) ou M. terrae (ATCC 15755).
- Il est préparé par l'utilisateur du kit.
- Ce réactif, traité comme un échantillon, contrôle les étapes d'extraction, d'amplification et de détection.
- Il est recommandé de réaliser régulièrement un contrôle négatif d'extraction.
AMTDT Gen-Probe®
1 seul type de contrôle négatif
- Le réactif est constitué d'une suspension de mycobactéries autre que celle du complexe Mycobacterium tuberculosis, ex : M. gordonae (ATCC 14470) ou M. terrae (ATCC 15755).
- Il est préparé par l'utilisateur du kit selon une procédure indiquée par le fabricant.
- Il contrôle les étapes les étapes d'extraction, d'amplification et de détection.
- Ce contrôle doit être réalisé obligatoirement, au moins une fois, à chaque série.
La négativité de ces contrôles, (cf. interprétation des résultats en annexe du document) est indispensable pour valider la série.
c - Contrôles de contamination du laboratoire
Ce contrôle est recommandé pour dépister une contamination du laboratoire par des amplicons de M. tuberculosis.
Protocole :
- Mettre 1 ml d'eau stérile dans un tube propre. Humidifier un écouvillon stérile en polyester ou en Dacron avec de l'eau stérile.
- Essuyer largement les diverses surfaces de travail et/ou le petit matériel utilisé avec cet écouvillon.
- Placer l'écouvillon dans le tube et mélanger doucement. Enlever l'écouvillon en le pressant sur la paroi du tube; puis jeter l'écouvillon dans un récipient contenant une solution de désinfectant.
- Tester ensuite 50 µl de la solution ainsi obtenue comme un échantillon suivant la procédure indiquée dans la fiche technique .
Un résultat positif rend nécessaire une décontamination des surfaces (cf. PR-HS-002).
- Il est impératif de vérifier les résultats faiblement positifs par un 2ème test d'amplification.Ceci concerne les échantillons avec les valeurs obtenues :
- entre 0.35 et 1 pour AMPLICOR Roche
- entre 1 et 2 pour LCx Abbott
- entre 30 000 et 500 000 pour AMTDT Gen-Probe
- Il est recommandé de réaliser un 2ème test d'amplification pour les échantillons dont le résultat est négatif mais proche de la valeur seuil.
Ceci concerne les échantillons avec les valeurs obtenues :
- entre 0.1 et 0.35 pour AMPLICOR Roche
- entre 0.2 et 1 pour LCx Abbott
- entre 20 000 et 30 000 pour AMTDT Gen-Probe
e - Recherche d'inhibiteurs de l'amplification
La recherche des inhibiteurs d'amplification est fortement recommandée pour les échantillons positifs à l'examen microscopique direct avec un résultat négatif pour le test d'amplification.La procédure est différente selon le test d'amplification.
AMPLICOR ®(Roche)
Il s'agit d'un contrôle interne d'amplification grâce à un plasmide ajouté au réactif d'amplification et révélé par une sonde spécifique autre que celle du complexe Mycobacterium tuberculosis.
Les réactifs sont fournis par le fabricant du kit.
Le test d'amplification avec la recherche d'inhibiteurs nécessite une seule extraction suivie d'une seule amplification suivie de 2 détections ( manuelles ou automatisées ).
Remarques
w En cas de résultat positif avec la sonde MTB, le résultat obtenu avec le contrôle interne d'amplification n'a aucun intérêt.
w En cas de résultat négatif avec la sonde MTB, les valeurs de DO du contrôle interne mesurée à 660 nanomètres sont, en l'absence d'inhibiteurs, supérieures à 2. En-dessous de cette valeur un résultat négatif obtenu avec la sonde MTB n'est pas interprétable.
LCx (Abbott)®
Une solution d'ADN de Mycobacterium tuberculosis est nécessaire.
Elle est préparée par l'utilisateur du kit selon la fiche technique en annexe du document.
Le test d'amplification avec la recherche d'inhibiteurs nécessite une seule extraction suivie de 2 amplifications avec détection.
AMTDT (Gen-Probe)
Une suspension bactérienne du complexe Mycobacterium tuberculosis (ATCC 25177 ou 27294) est nécessaire.
Ce réactif est préparé par l'utilisateur du kit selon la fiche technique en annexe du document.
Le test d'amplification avec la recherche d'inhibiteurs nécessite 2 extractions suivies de 2 amplifications avec détection.
L'utilisation des témoins positifs et négatifs n'est pas systématique. Elle doit se faire en cas de discordance évidente entre l'identification classique et les résultats des tests d'hybridation.Le témoin positif peut être une souche de référence (exemple M. tuberculosis H37Rv ou ATCC 25177 ou 27294) ou une souche clinique pour laquelle l'identification biochimique est indiscutable.
Le témoin négatif peut être une souche identifiée avec certitude à une espèce différente.