Azay-Mycobactéries

PROCEDURE Hygiène-sécurité

PR-HS-001 Rév A

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Sommaire

 

I - Objet

II - Domaine d'application

III - Documents de référence

IV - Risques biologiques et chimiques

V - Risques non spécifiques

VI - Mesures à prendre en cas d'accident

VII - Entretien des locaux

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I - Objet

La présente procédure a pour objet de définir les règles d'hygiène, de sécurité et d'entretien des locaux, afin de prémunir l'ensemble du personnel du laboratoire contre les risques biologiques connus et inconnus, les risques chimiques et les risques non spécifiques (incendie, explosion), susceptibles de survenir lors de la manipulation des prélèvements et aux différentes étapes de l'analyse.

 

 II - Domaine d'application

Cette procédure s'applique à l'ensemble des biologistes, internes, techniciens(nes), aides de laboratoires, personnel d'entretien des locaux et secrétaires.

 

 III - Documents de référence

. Guide de Bonne Exécution des Analyses. Arrêté du 2 novembre 1994.

. Circulaire du 8 août 1973.

. Code du travail article L231-46-1(décret n° 87200 du 25 mars 1987).

. Loi 92-654 du 13 juillet 1992.

. Revues "Travail et Sécurité" INRS, n° 505 et n° 517 juillet-août 1989.

. Décret n°92-1261 du 3 décembre 1992.

. Article R 361-61-1 du Décret du 4 mai 1994.

. Arrêté du 18 juillet 1994 (liste des agents biologiques pathogènes).

. Arrêté du 13 août 1996.

 

Il n'existe à ce jour aucun texte récent relatif à la recherche des mycobactéries dans les laboratoires d'analyses biologiques.

 

 

IV - Risques biologiques et chimiques

1 - Modes de contamination

2 - Mesures préventives d'hygiène et de sécurité

 

 

Tout prélèvement biologique ( sang, urine, selles, crachats, LCR...) doit être considéré comme potentiellement infectieux et manipulé comme tel.

Tout réactif doit être considéré comme potentiellement toxique et manipulé en respectant les conseils d'utilisation donnés par le fournisseur.

La manipulation des mycobactéries constitue un risque, celui-ci est maximum avec les mycobactéries du complexe tuberculosis.

 

 

1 - Modes de contamination

Direct : manipulations des prélèvements, des réactifs,.mais surtout manipulation des souches microbiennes.

Indirect : surfaces de travail, matériels, équipements,...

 

Portes d'entrée :

. Voie oro-respiratoire

Respiration d'air chargé d'aérosols contaminés.

Pipetage à la bouche.

La plupart des infections de laboratoire par les mycobactéries sont attribuées à l'inhalation d'aérosols pouvant contenir des bacilles acido-alcoolo-résistants. Les aérosols les plus dangereux sont ceux qui contiennent les particules les plus petites (< 5 µ) qui restent longtemps en suspension dans l'air et pénètrent jusqu'aux alvéoles pulmonaires.

Manipulations risquant de produire des aérosols :

- Utilisation de centrifugeuses sans nacelles étanches.

- Utilisation d'agitateurs, sonicateurs, broyeurs, mortiers.

- Agitation d'une culture, aspiration, refoulement.

- Transvasement de liquides et décantation de surnageants.

- Projection lors de distribution de réactifs.

- Stérilisation par la flamme de l'anse de platine ayant servi à prélever des colonies microbiennes (manipulation à proscrire).

- Goutte de suspension microbienne tombée sur le plan de travail.

- Tubes cassés ou renversés.

  . Voie cutanée

- Auto-inoculation par piqûre avec une aiguille, une pipette,...

- Blessures cutanées avec du verre cassé et contaminé.

- Infection par l'intermédiaire de blessures ou de lésions cutanées non protégées.

Dans le cas de M. marinum et M. ulcerans, le mode de transmission est essentiellement cutané.

 

. Voie conjonctivale

- Projection d'éclaboussures, d'aérosols, ou de pulvérisations.

 

 

2 - Mesures préventives d'hygiène et de sécurité

Les mesures préventives d'hygiène et de sécurité prennent en compte plusieurs critères :

- L'aménagement du laboratoire

- La protection, la formation du personnel et la surveillance médicale

- La mise en place d'équipements spécifiques de prévention

- Le suivi des bonnes pratiques de manipulation.

 

 

Aménagement du laboratoire

Selon l'arrêté du 18 juillet 1994 relatif à la classification des agents biologiques pathogènes, les mycobactéries du complexe tuberculosis sont classés dans le groupe 3.

L'arrêté du 13 août 1996 précise que les agents biologiques du groupe 3 doivent être manipulés dans des laboratoires de niveau de sécurité biologique 3.

 

Conception du laboratoire de niveau de confinement 3

La conception du local en pression négative doit répondre aux normes de niveau de confinement 3.

- Le laboratoire doit disposer d'un local fermé en pression négative et dédié à la recherche des mycobactéries. Ce local doit être spacieux pour éviter les mélanges de matériel propre et de matériel sale.

- Un pictogramme signale cette particularité du laboratoire.

- L'accès au laboratoire est réglementé et verrouillable: la liste des personnes autorisées à pénétrer dans le laboratoire doit être affichée à l'extérieur du sas et régulièrement actualisée.

- L'accès au laboratoire s'effectue par un sas, il est en surpression et doit être équipé d'un lavabo dont les robinets sont manoeuvrés sans utiliser les mains, d'un distributeur de savon doux liquide, d'une poubelle, d'un espace de rangement pour les vêtements de protection propre et d'un espace de rangement pour les vêtements sales.

Les portes d'accès au sas et au laboratoire sont asservies et ne peuvent être ouvertes en même temps.

 

Le personnel : protection, surveillance médicale et formation.

. La protection

Les vêtements de protection devront être adaptés : surblouse autoclavable ou à usage unique, chaussures réservées au laboratoire de mycobactériologie ou surbottes. Les vêtements de protection souillés seront autoclavés avant la sortie du local. Le port de gants est obligatoire pour la manipulation des échantillons biologiques. L'utilisation de masque (Racal Delta P1) est recommandée pour certaines manipulations hors du poste de sécurité microbiologique.

Lavage des mains : Les lavabos et les éviers seront équipés de robinets à commande d'ouverture non manuelle, d'un distributeur d'antiseptique avec à proximité un distributeur d'essuie-mains papier et une poubelle.

Toutes les surfaces de travail, y compris l'intérieur des postes de sécurité microbiologique doivent être nettoyées avec les désinfectants appropriés après le travail. Le nettoyage est assuré par les personnes ayant manipulé. Pour limiter la contamination, les manipulations sont effectuées au-dessus d'un plateau amovible facilement décontaminable sous la hotte.

 

 . La surveillance médicale

Elle doit reposer sur des visites médicales annuelles ou semestrielles en fonction de l'évaluation du risque. Le dépistage radiologique annuel systématisé doit être maintenu dans les services à risques. La liste du personnel exposé aux mycobactéries est communiquée au Médecin du Travail et conservée au moins 10 ans après la fin de la dernière exposition connue.

. La formation du personnel

Une formation spécifique au travail en P3 doit être assurée à tout nouveau personnel et régulièrement actualisée.

 

 

Les équipements et leur utilisation

. Le poste de sécurité microbiologique (PSM)

Le PSM constitue l'équipement majeur pour la sécurité d'un laboratoire de mycobactéries. Il doit toujours être en bon état de marche, régulièrement contrôlé et entretenu afin d'assurer la sécurité du personnel. Les PSM de type I et II répondent à ce besoin. Toutefois, le contrôle des flux d'air dans les PSM de type II peut s'avérer plus délicat que dans les PSM de type I. Le PSM devra être suffisamment spacieux pour permettre l'installation du matériel nécessaire aux manipulations. Celui-ci sera réduit au minimum strictement nécessaire et placé dans des endroits judicieusement choisis pour éviter de perturber le cheminement du flux d'air. Des contrôles réguliers du bon fonctionnement doivent être assurés par les services techniques compétents. De plus une surveillance interne mensuelle est réalisée, on utilise des fumigènes qui permettent de visualiser le bon cheminement du flux. L'utilisation des becs Bunsen à l'intérieur des PSM de type I est possible mais elle est à proscrire dans les types de PSM II. Les rayons UV ont une certaine efficacité vis-à-vis de la décontamination de l'air et des surfaces de travail mais nécessitent des conditions d'utilisation rigoureuses (puissance - distance du plan de travail - durée d'utilisation). Leur emploi sous la hotte pourrait être envisagé après manipulation et nettoyage du plan de travail.

Les utilisateurs doivent connaître et respecter les consignes d'utilisation préconisées par le fabricant. Elles devront être affichées.

Toute intervention technique sur le PSM doit être précédée d'une désinfection par formolisation.

 

 . L'autoclave spécifique répondant aux normes d'utilisation dans un P3

L'autoclave doit être a double entrée. Les produits dangereux sont donc mis dans le laboratoire et sont sortis stériles dans la laverie réservée à cet effet. Le matériel sera conditionné dans des sacs en plastique autoclavables et sera décontaminé avant son nettoyage ou son élimination. Chaque cycle de décontamination doit être rigoureusement contrôlé (durée - pression - température).

 

 . L'équipement de base spécifique et réservé au laboratoire des mycobactéries

L'unité de mycobactériologie devrait disposer de son propre matériel, celui-ci étant clairement différencié (couleur différente par exemple) de l'ensemble des matériels du reste du laboratoire. Il ne devrait être utilisé que dans cette partie du laboratoire de Bactériologie.

- Les centrifugeuses doivent être équipées de nacelles munies de couvercles. Etant donné que les tubes peuvent se casser ou couler pendant la centrifugation, il est recommandé d'ouvrir les nacelles sous hotte ; il est utile de prévoir un bac contenant une solution décontaminante pour immerger la nacelle en cas de bris de tube.

- Un réfrigérateur doit être réservé au stockage des produits non infectieux (réactifs, milieux de cultures). Un réfrigérateur et un congélateur servent au stockage des produits biologiques. Ils devront être identifiés par un pictogramme et être munis d'une serrure.

- Il est recommandé de regrouper les centrifugeuses, les agitateurs, le sonicateur dans un secteur du laboratoire permettant de minimiser les bruits.

- Le clavier des consoles informatiques doit être équipé de protège-claviers nettoyés une fois par semaine (ou dès que nécessaire) ou recouvert d'un film transparent qui sera régulièrement renouvelé. Les résultats écrits seront édités en dehors du laboratoire des mycobactéries. Les cahiers de paillasse, les crayons... restent dans le laboratoire. Les documents de paillasse peuvent aussi être faxés dans la partie non P3 du laboratoire où les documents concernant l'ensemble des analyses pourront être stockés librement.

- Le laboratoire doit être équipé soit d'un téléphone mains libres soit d'un interphone.

 

  Pratiques opératoires

- La manipulation des produits biologiques et des cultures doit être impérativement effectuée dans le PSM.

 

- A l'intérieur du PSM on doit disposer d'un conteneur spécifique pour l'élimination des aiguilles, des objets piquants ou tranchants souillés. Les surnageants doivent être éliminés dans un récipient à col étroit. S'il ne contient pas de désinfectant approprié, il sera fermé en fin de manipulation et autoclavé.

 

- Les procédures techniques doivent être optimisées de manière à éviter la production d'aérosols. On aura toujours à portée de main des carrés à usage unique qui pourront être imprégnés de désinfectant. Ils serviront à essuyer l'extérieur des tubes et à protéger l'ouverture d'un tube.

 

- Les anses métalliques seront remplacées par du matériel plastique à usage unique ou à défaut, elles devront être stérilisées dans un bec incinérateur. En aucun cas, elles ne devront être flamblées.

 

- Les pipettes en verre seront remplacées par du matériel plastique à usage unique et seront évacuées dans des conteneurs en polypropylène rigides résistants aux chocs et aux solvants avec fermeture définitive possible. Ils peuvent être autoclavés à la sortie du laboratoire avant d'être incinérés.

 

- La fixation par la chaleur des frottis sur une platine chauffante (65°pendant 2 h à 2 h 30 mn) ne détruit pas toutes les mycobactéries présentes sur les frottis. Ces frottis doivent être manipulés avec précautions. Une fixation par l'alcool méthylique pendant 10 mn précédant la coloration assure la destruction des mycobactéries.

 

- Après ensemencement des milieux de culture à partir des prélèvements décontaminés, les culots de centrifugation peuvent être chauffés à 70° C pendant 15 minutes dans un bain marie avant d'être utilisés pour la préparation des lames d'examen microscopique direct, la PCR, etc... de façon à "pasteuriser" le prélèvement. En effet, d'après Cerf et coll., à 70° C, en 0,3 minute, une culture de M. tuberculosis voit ces bacilles viables diminuer d'un log décimal.

 

- Inactivation du matériel contaminé et des déchets : bien que la législation n'oblige pas à autoclaver les produits biologiques et les cultures positives, il est conseillé de les autoclaver avant l'incinération. En absence de confinement 3, tous les produits biologiques et les tubes de cultures peuvent être éliminés dans des conteneurs hermétiquement clos qui seront incinérés.

 

V - Risques non spécifiques

Le plan d'évacuation du laboratoire indiquant des issues de secours, des extincteurs, de la couverture anti feu, etc... est affiché au laboratoire, ainsi que les n° téléphoniques d'urgence.

En cas de feu sur une personne, il faut étouffer les flammes avec la couverture anti feu, ou à défaut, avec un vêtement (blouse, pull en laine); allonger la victime sur le sol, pour protéger les yeux et les voies respiratoires.

En cas de brûlures graves, il faut immédiatement procéder à une évacuation par le SAMU (n° d'appel...) ou les pompiers (n° d'appel...).

 

 

VI - Mesures à prendre en cas d'accident

1 - Accidents corporels

2 - Accidents matériels

3 - Décontamination - Désinfection

 

 

 

1 - Accidents corporels

Identifier le plus précisément possible la nature de l'accident

En cas de coupures ou piqûres :

- Nettoyage abondant à l'eau, puis désinfection à l'eau de javel à 1,2° chlorométrique (1 berlingot qsp 1 litre d'eau, dilué au 1/10) pendant 10 mn

- Identifier le matériel contaminant.

- Contacter un médecin.

- Faire une déclaration sur le registre du laboratoire, une auprès du médecin du travail ainsi qu'une auprès du Directeur Administratif.

 

En cas de projection dans les yeux :

- Prévoir un rince oeil

- Rincer abondamment à l'eau ou au sérum physiologique pendant au moins 5 minutes.

- Contacter l'ophtalmologiste ou un médecin qui évaluera les risques.

- Même procédure de déclaration que précédemment.

 

En cas de projection sur les muqueuses :

- Laver à l'eau et contacter le médecin.

 

Remarque :

w Signaler dans les jours qui suivent toute manifestation clinique à un médecin.

 

 2 - Accidents matériels

Bris de tubes ou tubes renversés :

Sous la hotte :

- Recouvrir d'eau de javel à 12° chlorométrique. Laisser agir au moins

15 mn.

- Avec des gants épais, absorber le liquide à l'aide de papier et éliminer

les débris dans un contener adéquat.

- maintenir la hotte en état de marche.

 

hors de la hotte :

- Mettre un masque

- Recouvrir d'eau de Javel à 12° chlorométrique

- Faire évacuer les personnes présentes

- Sortir de la pièce que l'on verrouille

- Laisser agir 30 minutes, puis éliminer les déchets, comme précédemment puis pulvériser un désinfectant à base d'aldéhyde si la pièce n'est pas en dépression.

- Nettoyage complet de la pièce.

 

dans la centrifugeuse

Les nacelles sont ouvertes sous la hotte et immédiatement plongées dans un bain de solution désinfectante (dont l'activité est validée pour les bacilles de la tuberculose).

 

 

 3 - Décontamination - Désinfection

Action des agents chimiques sur les mycobactéries.

 

 

Tableau 1: Activité de désinfectants sur les mycobactéries

(temps de contact : 20 mn à 20°C)

 

 

 

 

VII - Entretien des locaux

 

Le nettoyage et l'entretien du sol et des murs (qui doivent être libres d'accès), doit être effectué par le personnel du laboratoire qui aura suivi une formation adéquate.

 

- le sol

La désinfection de ces surfaces n'aura d'intérêt que si elles sont propres, dépoussiérées à l'aide d'un balai trapèze humidifié. On préconise un nettoyage-désinfection avec l'emploi d'un détergent neutre associé à une solution nettoyante à fort pouvoir désinfectant, détergent désinfectant ayant été validé pour les bacilles de la tuberculose (ex. : eau de Javel à 3° chlorométrique ou produit à base de glutaraldéhyde).

 

- Les plans de travail, surfaces contaminées, centrifugeuses, réfrigérateurs, étuves,

On utilise une solution d'eau de Javel préparée quotidiennement (solution à 3¡ chlorométrique) puis rincer à l'eau. Dans le cas de surfaces en inox, utiliser une solution détergente-désinfectante validée pour les bacilles de la tuberculose (cf. désinfection, décontamination).

 

- Le petit matériel

Tout le matériel qui résiste à la chaleur sera préférentiellement autoclavé avant d'être nettoyé puis stérilisé.

Les portoirs, plateaux, pots à centrifuger, etc... seront nettoyés, désinfectés quotidiennement à l'aide d'une solution d'eau de Javel à 3° chlorométrique ou de toute autre substance désinfectante efficace sur les mycobactéries, puis rincés à l'eau.

Les matériaux ne supportant pas l'eau de Javel seront désinfectés par une solution nettoyante-désinfectante (cf. désinfection, décontamination), par trempage d'au moins 30 minutes (temps de contact à ajuster en fonction du produit utilisé). Les récipients contenant les solutions décontaminantes-désinfectantes devront être munis d'un couvercle. Tout ce matériel devra être nettoyé sur place et ne pas quitter la pièce.

 

 

ANNEXES

 

 1 - Décret n° 94-352 du 4 mai 1994 relatif à la protection des travailleurs contre les risques résultant de leur exposition à des agents biologiques et modifiant le code du travail - J.O. du 6 mai 1994

 

 2 - Arrêté du 18 juillet 1994 fixant la liste des agents biologiques pathogènes - J.O. du 30 juillet 1994

 

 3 - Arrêté du 13 août 1996 fixant les mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en oeuvre dans les industries et les laboratoires de recherche et d'enseignement où les travailleurs sont susceptibles d'être exposés à des agents biologiques pathogènes - J.O. du 7 septembre 1996

 

 

BIBLIOGRAPHIE

 

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(2) Tuberculose et personnel de santé. Numéro spécial janvier 1997 in Bulletin épidémiologique hebdomadaire (BEH). Tuberculose Traitement et Prévention.

 

(3) O. CERF, X. DOUSSET, J. BROSSARD - 1990. Pasteurisation et stérilisation thermique p 312 - 331 in Microbiologie alimentaire. Aspects microbiologiques de la sécurité et de la qualité alimentaires - tome 1 - Ed. Lavoisier. Tec & Doc. Apria.

 

(4) M. BEST, S.A. SATTAR, V.S. SPRINGTHORPE, M.E. KENNEDY - 1990. Efficacies of selected desinfectants against M. tuberculosis - J. Clin. Microbiol. 28 : 2234 - 2239

 

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(6) J.C. DARBORD, C. DUMARTIN - 1994. Activité des désinfectants sur les bactéries du genre Mycobacterium. Et l'Hygiène. AP - HP n¡ 39

 

(7) J. FLEURETTE, J. FRENEY, M.E. REVERDY - 1995. Antisepsie et désinfection. Ed. ESKA

 

(8) Liste positive Désinfectants - Hygiènes - Revue officielle de la Société Française d'Hygiène Hospitalière - 1997