1. INTRODUCTION

La mélioïdose est une affection peu rencontrée en France, car il s’agit d’une maladie rare et exotique, due à une bactérie tellurique et hydrique: Burkholderia pseudomallei. Cette maladie est due à un bacille à Gram négatif aérobie strict qui se rencontre essentiellement entre les 20ème parallèles nord et sud avec une nette prédominance dans le sud-est asiatique et le nord de l'Australie. Son taux de mortalité est d’environ 30-40% en l'absence de traitement.

- D’autres zones d’endémie existent en Afrique ou encore en Amérique du Sud. La maladie peut être autochtone en France, suite à l’épizootie de la ménagerie du Jardin des Plantes de Paris, en 1975. Il peut s'agir d'une zoonose, le germe étant tellurique.
Cette maladie est opportuniste, rapportée préférentiellement chez des patients immunodéprimés dont le traitement est long et difficile avec un mauvais pronostic (taux de létalité et celui de rechute élevés).

- L' origine exotique n'exclut nullement son implication en Europe comme en France où plusieurs cas annuels sont rapportés. D'ailleurs, suite au tsunami de décembre 2005, une alerte a été lancée en France.

- La découverte en France est le plus souvent fortuite chez des malades hospitalisés. D'ailleurs, la galerie d'identification biochimique telles API 20E API 20NE...... peut rapidement vous orienter et le diagnostic de cette bactérie devra être confirmé le plus rapidement possible.

- Enfin, il s'agira d' un agent potentiel du bioterrorisme (agent biologique de la classe 3) (http://www.cnrs.fr/SDV/Dept/ogmclassi2.html).

Guide d'investigation: http://www.agmed.sante.gouv.fr/htm/10/biotox/morve.pdf

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2. HISTORIQUE

http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/bb/pseudomallei.html

. La mélioïdose et la bactérie (Pseudomonas pseudomallei) furent observées pour la première fois par le capitaine A. Whitmore, pathologiste anglais, et son assistant, CS. Krishnaswamiv à l’hôpital général de Rangoon (à droite) en Birmanie chez un opiomane (1911). Cette maladie fut, ensuite, rapportée chez 38 cas d'infections de type septicémie, associée à de nombreux abcès caséeux (poumons, foie, rate).

. En 1921, Stanton et Fletcher rapportent aussi les infections chez l’animal en donnant le nom de pseudomorve qui montre de nombreuses similitudes cliniques et anatomo-pathologiques avec la morve dont l’agent est Burkholderia mallei. La morve est une infection pulmonaire des équidés transmise accidentellement à l'homme. Cette maladie a été éradiquée en France par la vaccination systématique des chevaux au début du siècle dernier. http://musee.vet-alfort.fr/Site_Fr/textemorv.htm

. La mélioïdose fut décrite dans plusieurs pays du sud-est asiatique: Sri Lanka ( 1927), Singapour et Indochine en 1932. Jusqu'en 1949, on a longtemps pensé que la mélioïdose était surtout localisée en Asie. Dans les années 1950, une centaine de cas fut identifiée parmi les 400.000 soldats français en Indochine, puis dans les années 70, parmi les soldats américains (343 cas avec 36 décès) lors de la guerre du Vietnam. Sur les 2,5 millions de soldats américains, le nombre de cas de mélioïdose sub-clinique est estimé à 225.000. Enfin la maladie peut être rapportée dans certains pays chauds comme les États-Unis, Panama et la Turquie chez des malades n'ayant été en zone d’endémie. L’Afrique n’est pas épargnée avec l’isolement de la bactérie chez l’animal (porc) dès 1936 et le premier cas humain au Tchad (1960). Le bacille de Whitmore fut retrouvé en Iran chez le cheval (1943) puis dans les eaux et les rizières. Cette bactérie est très connue dans certaines régions du globe. De nombreuses espèces de mammifères y sont sensibles, ainsi en 1975, 24 dauphins de l’aquarium océanique de HongKong décèdent de mélioïdose.

http://web.kku.ac.th/~melioid/index.htm

. En France, le bacille fut isolé, pour la première fois, chez une jument de Prejwalski morte en 1975 au Jardin des Plantes. D’autres espèces animales en moururent (mouflon du Canada, singe Patas, cerfs Sika, un tatou….). Divers isolements du germe ont été positifs à partir d'échantillons du sol de plusieurs régions françaises. Des cas équins ont été rapportés dès 1976: Yvelines, Seine-et-Marne puis Normandie, Camargue, Aquitaine.......
L’hypothèse de l’origine de cette contamination semblait fortement liée à l’importation d’un panda, cadeau de Mao Tse Tung au président Pompidou (1973) en provenance d’un site géographique infecté. Celui-ci placé au parc zoologique de Vincennes y décéda quatre mois plus tard. L’autre hypothèse était la contamination par l’intermédiaire de 2 chevaux d’Iran offerts à Madame Pompidou par le Shah en 1971, en contact avec les chevaux de Prejwalski. Cependant, il n’y a pas eu de mélioïdose déclarée chez ces animaux.
Enfin, 3 cas humains de mélioïdose dont 2 décès furent rapportés, suite à cette épizootie équine et B. pseudomallei a été ioslé par hémoculture chez 2 personnes asymptomatiques.
Quelques cas annuels de mélioïdose humaine sont régulièrement rapportés, le plus souvent chez des immigrés asiatiques implantés en France ou des patients immunodéprimés revenant de zones d’endémie. Le tsunami de décembre 2005 a amené les autorités françaises à lancer une alerte : http://www.invs.sante.fr/presse/2005/le_point_sur/tsunami_020205/

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3. TAXONOMIE - CLASSIFICATION

Ces bactéries appartiennent au beta-proteobacteria, à l'ordre des Burkholderiales et à la famille des Burkholderiaceae avec les genres Burkholderia, Pandoraea, Ralstonia...... Le germe de la mélioïdose a été primitivement dénommé par A. Whitmore, Bacillus pseudomallei. En 1957, Haynes le transfère dans le genre Pseudomonas et classé dans le groupe génomique II. Cette bactérie a été récemment individualisée (Yabuuchi et coll., 1992) en un nouveau genre Burkholderia sur des critères génomiques ou non : séquence ARNr 16S, homologies ADN-ADN, composition des acides gras et caractéristiques phénotypiques.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=32008
http://www.bacterio.cict.fr/b/burkholderia.html

Ce genre compte au moins 6 espèces d'intérêt médical dont Burkholderia pseudomallei, très proche de B. mallei, responsable de la morve, très ressemblante à la mélioïdose. Ces 2 bactéries ne forment qu’une espèce unique (plus de 90 p. cent d'homologie ADN - ADN). Seules, la pathogénie et l’épidémiologie conduisent à maintenir l’existence d'espèces différentes comme Escherichia coli et Shigella spp..

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4. PRINCIPAUX CARACTERES BACTERIOLOGIQUES

. B. pseudomallei est un bacille à Gram négatif (coloration bipolaire +), de 0,5 à 2 mm de longueur, non sporulé, exprimant des exopolysaccharides de surface (microcapsule)(synthèse constitutive), mobile grâce à une ciliature polaire et multitriche.

. La température optimale de croissance est comprise entre 37-39 °C, mais nombre de souches cultivent bien à 42 °C. La croissance est rapide sur les milieux ordinaires et les colonies obtenues après 24 heures d'incubation sur gélose nutritive sont petites, rondes, bombées, blanchâtres et d'un diamètre de 2 à 3 mm. Après 48-72 heures d'incubation, les colonies s'agrandissent (diamètre de 5 à 10 mm), elles sont opaques, de couleur crème et dégagent une odeur de terre ou de truffe. Fréquemment, une dissociation entre colonies lisses (S) et celles rugueuses (R) ayant un aspect plissé, ridé et ombiliqué est observé.

Cultures sur le milieu de Mueller-Hinton à 37°C après 30 h (haut, milieu) et 72 h (bas)

. Les autres caractères majeurs d'orientation sont: catalase +, oxydase +, aérobie stricte mais capable de croître en anaérobiose en présence de nitrate ou d'arginine (respiration anaérobie comme P. aeruginosa), ADH +, gélatinase +, acidifiant le glucose et le galactose, accumulant du poly-bêta-hydroxybutyrate comme matériel de réserve. Le "chromosome" héberge des séquences d'insertion identiques à celles retrouvées chez B. cepacia. D'autres caractères bactériologiques sont rapportés par ailleurs :

http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/bb/pseudomallei.html

http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/bb/tmallei.html

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5. HABITAT

Cette espèce comme B. thailandensis est présente dans le sol (boue, sédiments) et dans les eaux (mares, marigots, rizières.......) en zone tropicale. Ces bacilles hydro-telluriques peuvent aussi vivre en dehors de ces régions tropicales et résistents très bien au froid. L'eau douce dans laquelle sont exportés des poissons exotiques peut être contaminée ayant pour conséquence, une contamination des aquariums.

6. POUVOIR PATHOGENE

. Pratiquement tous les mammifères, dont l'homme, sont sensibles: domestiques (chevaux, petits ruminants, porcs, bovidés, camélidés, lapins, carnivores ...) ou sauvages (éléphant, mouflons, oryx, patas, callitriche, cerf sika, tatou, rongeurs sauvages, cob, buffle, dauphins, ...). De nombreuses espèces d'oiseaux (pigeon, oie, pingouins, ...) sont moins sensibles.

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7. PHYSIO-PATHOGENIE

. B. pseudomallei est une bactérie intracellulaire facultative dont les facteurs de pathogénicité restent mal connus. L'endotoxine montre les activités biologiques classiques. La fraction polysaccharidique du LPS est constituée de deux chaînes différentes (O-PSI et O-PSII) présentes en quantités à peu près égales. Les anticorps, notamment contre le composant O-PSII, jouent un rôle protecteur, en facilitant la phagocytose. La capsule polysaccharidique joue probablement un rôle antiphagocytaire permettant au bacille de survivre dans les macrophages et autres cellules phagocytaires de l’hôte.Un exopolysaccharide de masse moléculaire (>150 kDa) produit constitutivement aide à former une barrière protectrice.
. Cette bactérie active le complément par la voie alterne et celle classique. Les opsonines C3b et iC3b permettent l'ingestion de la bactérie par les granulocytes neutrophiles et les macrophages. Celle-ci n'est pas suivie de la lyse bactérienne, le germe restant présent dans une vacuole et pouvant se multiplier.

. Suite au séquençage du génome composé de 2 chromosomes, on a mis en évidence la capacité de la bactérie de sécréter des exotoxines: protéases, lécithinases, lipases, catalases et hémolysines, capables d’endommager les cellules de l’hôte.Toutes ces substances ont des propriétés biologiques avec pour conséquences: nécrose tissulaire, hémolyse et cytolyse. Parmi les autres toxines produites, citons la toxine thermolabile, de composition chimique inconnue, létale pour la souris et le hamster, douée d'un fort pouvoir anti-coagulant. Une autre toxine thermolabile, enzyme protéolytique probable, est aussi excrétée par les bactéries en culture. Elle a une activité dermonécrotique pour le cobaye. Un glycolipide de 762 Da, excrété par le germe et à activité hémolytique, est toxique pour les cultures cellulaires. Il agirait à la manière d'un détergent. Une toxine cytoléthale (Cytolethal toxin ou CLT) a pu être isolée. Celle-ci aménerait à une mélioïdose avec septicémie.

. Parmi, les autres facteurs de virulence, une exotoxine protéique de 31.000 de poids moléculaire produite in vitro et in vivo, inhibe la synthèse protéique et celle de l'ADN des macrophages lors de culture. Une métalloprotéase de 36.000 de poids moléculaire est excrétée in vitro et in vivo. Elle est capable de dégrader le C3, les IgG, les IgA et donc d'inhiber les moyens de défense de l'organisme. Son action protéolytique sur la transferrine et l'hémoglobine participerait à l'acquisition du fer et celle sur le collagène et l'élastine jouerait un rôle dans la diffusion de la bactérie. Enfin la malléobactine, sidérophore (de type hydroxamate), de 1.000 Da (PM) est apte à capter plus efficacement le fer lié à la transferrine que celui lié à la lactoferrine.

. La mélioïdose septicémique est associée à la production de cytokines et à une importante réaction inflammatoire. De grandes concentrations de cytokines pro et anti-inflammatoires sont trouvées: Tumour Necrosis Factor (TNF), interleukine-6, interleukine-10, interféron g et interleukine-18 sont tous augmentés.

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9. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

* Commémoratifs
La mélioïdose doit être prise en compte dans le cadre du diagnostic différentiel d'un patient présentant une fièvre d'origine inconnue avec ou sans foyer, ayant voyagé, même s'il y a plusieurs années dans des régions chaudes et humides, surtout Sud-Est Asiatique avec la Thaïlande, l'Inde, le Vietnam, ou encore Hong-Kong au cours d'un voyage d'agrément ou à titre de coopérant. Ne pas oublier certains pays d'Afrique et des Caraïbes.

Il s'agira souvent d'un patient immunodéprimé (état diabétique, alcoolisme, VIH + .......), d'origine asiatique (Cambodgien, Vietnamien)

. Le diagnostic clinique est malaisé, du moins en France en raison de sa rareté. on pensera aux formes aiguës septicémiques avec constitution d'abcès viscéraux. L'évolution vers la mort (50-90 %) dépendra du traitement entrepris. On pourra y songer devant une forme pulmonaire de type tuberculose ou encore devant une forme chronique avec images d'infiltrats pulmonaires diffus, une pneumonie atypique, une arthrite, une ostéite fistulisée, ou encore un abcès intramusculaire.

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DEVANT TOUTE SUSPICION, PREVENIR LE LABORATOIRE

* Prélèvements : Dans le cadre d'un état septicémique, d'une tuberculose, d'une arthrite ..... seront adressés au laboratoire : hémoculture, expectoration, liquide articulaire, liquide pleural, liquide de lavage broncho-alvéolaire ..............

* Aspects culturaux : Cette espèce pousse facilement à 37°C en 24-48 h en atmosphère ambiante sur les milieux de culture d'usage courant tels bouillons commerciaux pour hémoculture, gélose au sang frais, gélose chocolat, gélose trypticase soja ou encore milieu de Mueller-Hinton. La culture peut aussi s'obtenir à 20°C.

Lors de contamination des prélèvements par une flore associée (aspirations trachéo-bronchiques), ou à partir d'échantillons du sol, l'emploi de milieux sélectifs est possible. B. pseudomallei et B. thailandensis ont des caractères phénotypiques très voisins mais sur le milieu sélectif de Ashdown, les colonies de B. pseudomallei sont rugueuses et pigmentées en pourpre foncé (ci-dessous), celles de B. thailandensis étant lisses et rose:

http://www.hpa.org.uk/infections/topics_az/deliberate_release/Glanders/homepage.asp#row2

Ce milieu sélectif, surtout utilisé en zone endémique, comporte du glycérol, du cristal-violet, du rouge neutre et de la gentamicine ou encore après modification, de la colistine:

http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/bb/pseudomallei.html

Autre milieu sélectif : Celui de Galimand-Dodin est un milieu minimum contenant de la thréonine pouvant être supplémenté avec de la colistine (50 mg/l)(résistance naturelle).

* Autres caractères d'identification
Si l'aspect des colonies est non caractéristique, celui observé sur une gélose de Drigalski oriente immédiatement sur un bacille à Gram-négatif aérobie non fermentaire (petites colonies lactose-négatif après 24 h d'incubation entre 20 et 37°C).

Aussi sera recherchée l'oxydase, voire la catalase qui est faible.

Dans la pratique d'un laboratoire de bactériologie médicale, sera souvent ensemencée, en première intention, une galerie API 20E qui oriente rapidement (24 h) vers une souche de P. aeruginosa compte tenu des caractères suivants: ADH +, CIT +, gélatinase +, NO₃ +, "non fermentaire". L'antibiogramme, obtenu dans le même laps de temps, sera très contributif au diagnostic (cf plus loin):

En deuxième intention, sera ensemencée une galerie API 20NE, lue après 48 heures d'incubation à 30°C, permettant d'obtenir les résultats suivants :

- Caractères positifs : réduction des nitrates, ADH, gélatinase, assimilation de substrats (glucose, mannose, mannitol, N-acétyl-glucosamine, gluconate, caprate, adipate et malate).
- Caractères négatifs : glucose (fermentation), uréase, indole, ONPG, assimilation du maltose (5 % +).
- Caractères variables : esculine (nombreuses souches hydrolysant l'esculine lors l'incubation prolongée > 48 heures), arabinose, citrate et phényl-acétate.

* Autres caractères de confirmation pouvant être recherchés :
. la respiration des nitrates ou respiration anaérobie (milieu mannitol-mobilité, par exemple).

. la culture en milieu liquide (bouillon coeur-cervelle, bouillon nutritif.....) avec l'aspect d'un germe aérobie strict avec un voile. Dans un bouillon peptoné, un trouble apparaît en surface puis descend progressivement tandis qu'un voile plissé et fragile se développe en surface.

. l'antibiotype (cf antibiogramme): On notera sa résistance naturelle aux polymyxines dont la colimycine (CS), aux aminosides telles la kanamycine (K), la gentamicine (GM), la nétilmicine (NET) ou encore la tobramycine (TM).

Le phénotype de résistance naturelle aux B-lactamines peut aussi être très utile pour l'identification. Il sera analysé plus loin.

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10. DIAGNOSTIC GENOMIQUE

Des techniques de détection rapide du germe par la réaction de polymérase en chaîne (PCR) et par hybridation sont utilisées dans des régions ou pays de forte endémicité ou encore par séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S. B. thailandensis isolée dans le Centre et le Nord-Est de la Thaïlande semble non pathogène mais est proche génomiquement de B. pseudomallei.

11. DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE

Il est de peu d'intérêt sous nos latitudes en raison de la rareté de cette affection. Diverses techniques sont utilisées telles agglutination, hémagglutination passive, fixation du complément, ELISA, mise en évidence des IgM par immunofluorescence ou immunoenzymologie.... ou par une technique utilisant des anti-IgM marquées par l'or colloïdal. Mais elles manquent de spécificité et/ou de sensibilité. En zone d'endémie, la recherche d'IgM peut permettre de différencier les infections actives des infections latentes/chroniques.

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. Les conditions habituelles d'un antibiogramme conviennent, à savoir: Milieu de Mueller-Hinton normal durant 20 à 24 h d'incubation à 37°C.

. Phénotype sensible
- On notera, avant tout, sa mutirésistance naturelle aux polymyxines dont la colimycine (CS), aux aminosides telles la kanamycine (K), la gentamicine (GM), la nétilmicine (NET) ou encore la tobramycine (TM) et enfin à certaines B-lactamines dont les pénicillines (amoxicilline, ticarcilline) et les céphalosporines de première ou deuxième génération mais une grande sensibilité à d'autres telles la ceftazidime. Attention, il y avoir sensibilité à la kanamycine.

- Cette espèce est sensible aux associations amoxicilline (AMX) ou ticarcilline (TIC) et acide clavulanique (AMC, TCC), définissant ainsi un phénotype "pénicillinase de bas niveau". Les autres antibiotiques actifs sont peu nombreux, classiquement le chloramphénicol (C), les tétracyclines (TET) et l'association triméthoprime-sulfaméthoxazole (SXT). Enfin l'activité antibactérienne in vitro des fluoroquinolones dont la ciprofloxacine (CIP) apparait médiocre. Parmi les ß-lactamines actives, il convient de citer les C₃G dont la ceftazidime (CAZ).

. Le traitement classique de plusieurs mois (6 à 12) fait appel au chloramphénicol, aux tétracyclines (doxycycline) ou à l'association triméthoprime-sulfaméthoxazole (cotrimoxazole), mais à la phase d'éradication. De nombreuses données comparatives d'essais cliniques permettent de mieux préciser celui-ci, en particulier, pour le traitement d'attaque par voie parentérale, lié à la prescription d'une ß-lactamine (ceftazidime, 7-15 jours). D'autres antibiotiques étaient ou sont potentiellement intéressants comme l'imipénème, la pipéracilline ou encore les associations amoxicilline-acide clavulanique, ampicilline-sulbactam ou mieux céfopérazone-sulbactam. Cependant l'émergence de la résistance est bien réelle et demande une surveillance du traitement. L'experience sur l'association doxycyline - ceftazidime est limitée lors du traitement initial.

http://umvf.cochin.univ-paris5.fr/article.php3?id_article=1001
http://www.eurosurveillance.org/em/v09n12/0912-138.asp
http://www.eurosurveillance.org/em/v10n03/1003-126.asp?langue=01&

- Après traitement par ceftazidime, la résistance peut quelquefois apparaitre chez les malades. Elle est identifiée par une synergie entre la ceftazidime et l'acide clavulanique. Après traitement par l'Augmentin^®, la résistance à cette association peut aussi apparaitre. Celle-ci est croisée avec le Timentin^® ainsi que vis-à-vis de certaines céphalosporines (céfotaxime, ceftriaxone).

- Au plan du mécanisme, le phénotype de résistance naturelle aux ß-lactamines est lié à la présence d'une ß-lactamase chromosomique de la classe A, peu inductible de type céfuroximase avec inactivation des pénicillines (amino et carboxypénicillines) et de certaines céphalosporines (céfalotine, céfaloridine, céfuroxime......). Cette enzyme chromosomique (BPS-1) peut être hyperproduite ou évoluer par mutation aussi in vitro qu' in vivo pour engendrer la résistance soit aux C₃G, soit aux associations de l'acide clavulanique avec une pénicilline.

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