BRUCELLA

- INTRODUCTION
La brucellose, maladie humaine au cent visages, quelquefois de diagnostic difficile, est une zoonose transmise à partir de diverses espèces animales (mammifères domestiques, le plus souvent) à l'homme qui est un hôte accidentel, par voie cutanéo-muqueuse (contact avec un animal infecté ou un objet contaminé) ou encore digestive (ingestion d'aliments crus contaminés tels lait, produits lactés, fromages.......).

Certaines espèces de Brucella sont pathogènes pour l'homme : B. melitensis (transmise surtout en France par les caprins et les ovins), B. abortus (bovins), B. suis (porcins), et selon les pays (non diagnostiquée en France): B. canis (canins) et très récemment, les nouvelles Brucella marines.

Certaines professions étant particulièrement exposées tels agriculteurs, éleveurs, vétérinaires et personnel d’ abattoir, il s’ agit d’une maladie professionnelle à déclaration obligatoire en France. (http://www.invs.sante.fr/surveillance/mdo/fiches/fiche_brucellose.pdf).

Cette zoonose a des répercussions importantes aussi bien pour la santé publique que pour l'économie de la plupart des pays en voie de développement. La maladie animale a été maîtrisée par une prophylaxie sanitaire et quelquefois médicale (vaccin) dans divers pays développés ayant entraîné une diminution considérable du nombre de cas humains. La France en constitue un exemple significatif. La brucellose bovine, ovine et caprine y est maintenant éradiquée depuis 2003.

- HISTORIQUE

La brucellose humaine a été clairement identifiée (entité nosologique avec la " fièvre de l'île") par les médecins militaires anglais dont AJ. Marston en 1859 sur l' île de Malte, une importante garnison anglaise y séjournant. L’agent causal de cette fièvre a été, finalement, isolé en 1887 par David Bruce, bactériologiste anglais stationnant à La Valette et ce, à partir de la rate de plusieurs militaires décédés. Le germe fût initialement dénommé "Micrococcus melitensis". En 1897, A. Wright décrit une approche diagnostique par la mise en évidence d'agglutinines sériques (séroagglutination lente en tube).

Le rôle de l'animal comme réservoir, en particulier la chèvre, a été bien démontré, en particulier, suite à la création de la "Commission britannique de la fièvre méditerranéenne" avec T. Zammit et Horrocks (1904-1907). Enfin la brucellose ou fièvre de Malte a été bien décrite dans les autres pays du pourtour méditerranéen.

La bacille de Bang a été cultivé au Danemark, dès 1895 par B. Bang, vétérinaire danois, à partir de produits d'avortements (foetus, cotylédons) dans des élevages bovins présentant des avortements à répétition (enzootie). Cette bactérie fut, donc, dénommée "Bacillus abortus".

Puis en 1914, aux Etats-Unis, un autre réservoir animal fut identifié, à savoir les porcins dans le cadre d'avortements (truies) par Traum.

La relation entre Micrococcus melitensis et Bacillus abortus n’a été établie qu’en 1917 par Alice Evans, bactériologiste américaine, qui proposa la création d'un genre, Brucella avec les espèces suivantes: B. melitensis, B. abortus et B. suis.

D'autres espèces ont été incluses ensuite dans ce genre, mais ces bactéries, restées longtemps sans famille, appartiennent maintenant à la famille des Rhizobiaceae:

* B. ovis, isolée de moutons, en particulier dans le cadre de stérilité du bélier en 1953:

*¨B. neotomae, espèce isolée en 1957 de rongeurs du désert (N. lepida) rencontrés dans les zones désertiques du Utah (États-Unis).

* B. canis identifiée en 1966 aux USA, par Carmichael comme agent d’avortements chez la chienne de race Beagle, très utilisée par l'industrie pharmaceutique.

* Enfin en 1994,ont été rapportées plusieurs espèces marines (B. cetaceae, B. pinnipediae), d'une part, chez un dauphin en captivité (lors d'un avortement) en Californie, d'autre part, chez les phoques ou marsouins. Depuis, plusieurs souches ont été isolées de cétacés et pinnipèdes marins en Amérique comme en Europe (du nord surtout). En France, une souche a été isolée en 1996 d'un dauphin à La Rochelle et en 2005, d'un marsouin dans le Cotentin (données du CNR). De rares cas humains ont été rapportés aux USA et en Grande-Bretagne notamment.

- TAXONOMIE- CLASSIFICATION

Les bactéries du genre Brucella appartiennent au groupe alpha des Proteobacteria (sous-groupe a2) et maintenant à la famille des Rhizobiaceae. Les espèces bactériennes, phylogéniquement les plus proches, sont les Bartonella, autres bactéries responsables de zoonoses; des bactéries de l’environnement, d'autres rarement isolées chez l’homme comme Ochrobactrum anthropi, Afipia felis.......) ; et enfin des bactéries pathogènes ou symbiotes de plantes comme Rhizobium, Agrobacterium.

Ces bactéries appartiennent aux alpha-Proteobacteria, à l'ordre des Rhizobiales et enfin à la famille des Brucellaceae avec les genres Brucella, Mycoplana, Ochrobactrum.....

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=234
http://www.bacterio.cict.fr/b/brucella.html
http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/bb/canis.html

Le genre a été divisé en, au moins, six espèces, séparées en biovars ou biotypes alors qu'au plan génomique, une seule espèce existe: B. melitensis. En effet, les études fondées sur l’hybridation ADN/ADN ou sur la séquence du gène codant pour l’ARN ribosomal 16S ont montré que le genre Brucella est monospécifique (B. melitensis), les anciennes espèces étant ramenées au rang de sous-espèces ou nomenspecies. Ces distinctions entre anciennes espèces ont, cependant, un intérêt au plan épidémiologique, ils existe des hôtes ou réservoirs de prédilection. prédilection et un niveau de pathogénicité selon l'espèce animale/humaine assez spécifique pour chaque espèce de Brucella ou certains biovars.
De nouvelles espèces "marines" ont été proposées afin de différentier les souches issues de mammifères marins: B. maris regroupe l’ensemble des souches de mammifères marins, puis B. cetaceae isolée de cétacés (baleines, cachalots, dauphins, marsouins) et enfin B. pinnipediae isolée de pinnipèdes (phoques, otaries, morses)

http://www.the-icsp.org/subcoms/brucella.htm

Plusieurs génomes sont maintenant connus pour les trois principales espèces: B. abortus, B. melitensis et B. suis. Le génome des Brucella est, en fait, constitué de deux réplicons circulaires, avec un ratio GC de 57–58 %. Le génome de B. melitensis 16M, comprend deux chromosomes circulaires de 1,17 et 2,11 Mbp (2001). Cette organisation est retrouvée chez B. abortus (2,12 et 1,16 Mbp) et B. suis 1330 (2,10 et 1,20 Mbp) respectivement en 2005 et 2002. Cependant, un seul chromosome circulaire de 3,2 Mbp a été observé pour B. suis biovar 3.

- PRINCIPAUX CARACTERES BACTERIOLOGIQUES

- Ceux sont de petits coccobacilles à Gram négatif (à gauche), mesurant 0,6 à 1,5 µm de long et de 0,5 à 0,7 µm de diamètre, non capsulés, non sporulés. A l'état frais, ils sont animés de forts mouvements browniens pouvant conduire à détecter une fausse mobilité.
Une caractéristique tinctoriale liée à l'acidorésistance de la paroi peut être révélée par certaines techniques colorimétriques (Stamp, par exemple) permettant un diagnostic bactérioscopique en médecine vétérinaire (placenta ovin à droite).

- Leur culture exige l’usage de milieux enrichis tels gélose Columbia au sang frais ou chocolat, la gélose trypticase soja additionné de sérum........ Les milieux commerciaux actuels conviennent bien. Certaines souches (certains biovars de B. abortus, B. neotomae, B. ovis...) se développent mieux en atmosphère contenant 5 à 10 % de CO2. La température de croissance optimale est 34-35°C. L’ isolement des Brucella, en particulier en primoculture, nécessite des temps d’incubation d'au moins 3 à 4 jours (automate d'hémoculture) jusqu'à 2 à 3 semaines. Les colonies sont translucides, rondes à bords réguliers. La culture en milieu liquide présente un trouble léger (exemple sur BHI, à droite).

- Caractères antigéniques
. Le lipopolysaccharide (LPS), antigène le plus immunogène est caractérisé par une variation de phase avec les phénotypes suivants: lisse ou "smooth" (S-LPS) et rugueux ou "rough" (R-LPS). Le S-LPS est retrouvé à l’état sauvage chez la plupart des espèces et biovars. Les chaînes latérales polysaccharidiques (antigène « O ») du S-LPS sont constituées d’un homopolymère comprenant environ 100 résidus de 4-formamido-4,6-didéoxy-D-mannopyranosyl, support principal des réactions croisées entre Brucella spp., Yersinia enterocolitica sérovar O : 9, Francisella tularensis, ou encore Vibrio cholerae O :1...... L’immunogénicité des protéines membranaires, périplasmiques ou cytoplasmiques est inférieure à celle du LPS.

Colonies S/R colorées selon la technique colorimétrique de White et Wilson

- L' identification ultérieure en espèce et biovar fait appel aux caractères suivants: exigence ou non en gaz carbonique (CO₂), production de SH2, la croissance ou non sur des milieux gélosés contenant des concentrations variables de colorants inhibiteurs tels thionine, fuschine basique ..... sensibilité variable aux bactériophages Tb, Wb, Bk, R/C..........

- Caractères génomiques
En pratique, la séquence du gène codant pour l’ARN ribosomal 16S peut être obtenue, mais le genre Brucella est monospécifique comprenant qu'une seule espèce: B. melitensis, les anciennes espèces étant ramenées au rang de sous-espèces ou nomenspecies. D'autres approches ont été récemment proposées (cf diagnostic).

- HABITAT - POUVOIR PATHOGENE NATUREL

Les Brucella sont des pathogènes intracellulaires facultatifs, parasites du sytème réticulo-histiocytaire. Elles sont pathogènes pour de très nombreuses espèces de mammifères, domestiques ou sauvages telles bovins, ovins, caprins, porcins, carnivores, lagomorphes, rongeurs mais aussi chevreuil, caribou, renne, bison et même mammifères marins tels dauphin, otarie......
La brucellose est essentiellement une maladie animale (zoonose) avec l'existence d'hôtes ou de réservoirs préférentiels.

Espèce	Biovars	Répartition	Hôte animal habituel	Pathogénicité homme
B. abortus	1 - 6, 9	Ubiquitaire	Bovins, ongulés sauvages	Modérée
B. melitensis	1 - 3	Bassin méditerranéen, Moyen Orient	Ovins, caprins, ongulés sauvages	Forte
B. suis	1 et 3	Amérique, Asie, Océanie	Suidés	Forte
B. suis	2	Europe centrale et occidentale	Suidés, lièvres	Faible *
B. suis	4	Amérique du Nord, Russie	Rennes	Modérée
B. suis	5	Russie	Rongeurs sauvages	Forte
B. canis		Ubiquitaire (fréquence élevée en Amérique du sud)	Chiens	Faible
B. ovis		Bassin méditerranéen	Ovins	Nulle
B. neotomae		Utah (États-Unis)	Rongeurs du désert	?
B. cetaceae		?	Cétacés (dauphins)	?
B. pinnipediae		?	Pinnipèdes (phoques, otaries)	? **

* Rares cas d’infections humaines rapportés dans la littérature
** Deux cas d’infection humaine, rapportés chez des patients péruviens, émigrés récemment aux États-Unis, et présentant une atteinte neurologique et comme facteurs de risque, une consommation régulière de fromages frais et de fruits de mer crus, ainsi qu'un cas de contamination au laboratoire en Grande-Bretagne..

La brucellose animale, malgré de rares cas d' arthrite ou d'hygroma, est essentiellement une maladie de la reproduction se caractérisant:

Survie-résistance : Les animaux infectés essaiment des Brucella dans l’ environnement, par leurs "eaux" au cours de l'avortement ou du vélage, leur placenta, leurs sécrétions vaginales chez les femelles infectées ou encore par le lait. Ces bactéries résistent plusieurs mois (en moyenne 3 mois) dans les conditions naturelles de conservation (lait, fromages, fèces, sol, eau, mur des étables ou bergerie.......), d'où d'éventuelles conséquences pratiques sur la contamination de l'homme.

Ces bactéries sont sensibles à la chaleur en milieu liquide, d'où l'efficacité de la pasteurisation du lait ou d'une ébullition de courte durée. Quelques minutes à 85°C suffisent pour préparer une suspension antigénique d'une souche à agglutiner pour l'identification antigénique.

- POUVOIR PATHOGENE CHEZ L'HOMME

Mode de transmission chez l’ homme :
Contact direct (pénétration du germe par voie cutanée ou muqueuse favorisée par des blessures ou des excoriations) avec des animaux malades par les carcasses ou mieux, produits d’ avortement (placenta, sécrétions vaginales) ou encore par contact accidentel au laboratoire avec des prélèvements (hémocultures…).

Ingestion d’ aliments contaminés (lait et produits dérivés non pasteurisés, plus rarement crudités contaminées par du fumier ou exceptionnellement abats insuffisamment cuits comme rate, foie, testicules.....). Les mains contaminées par un produit souillé peuvent entraîner exceptionellement une contamination par voie digestive.

Inhalation de poussière de litière, d’ aérosol contaminé dans un laboratoire, un abattoir ou encore dans une étable vide pour cause de la transhumance.

La transmission inter-humaine reste exceptionnelle, voire inexistante, car l' excrétion y compris par voie génitale n'a jamais été démontrée chez l'homme. Lorsque plusieurs membres d'une même famille ou d'une même communauté sont atteints, il est clair qu'ils sont, avant tout, le plus souvent exposés aux mêmes facteurs de risque décrits ci-dessus.

Les éleveurs, les fermiers, les vétérinaires, et les travailleurs des abattoirs sont professionnellement exposés à la maladie. La brucellose peut être contractée de façon accidentelle chez le personnel de laboratoire lors de la manipulation de cultures de Brucella ou de prélèvements biologiques contaminés. Un exemple inhabituel de contamination est celui d'artisans venant travailler dans une étable ou bergerie infectée bien que vide (pour cause de transhumance) ou lors de l'inoculation transcutanée par piqûre accidentelle d'un vaccin vivant de type B19, Rev-1....... chez les vétérinaires, et plus rarement les éleveurs.

Plusieurs phases sont individualisées :
http://www.emedicine.com/emerg/topic883.htm

- Primo-invasion aiguë (brucellose aiguë septicémique ou fièvre sudoro-algique): syndrome grippal banal ou encore il s’ agit de la fièvre ondulante sudoro-algique de début insidieux associée à des myalgies, arthalgies s’ accompagnant de sensations de malaise.

- Phase secondaire (brucellose sub-aiguë focalisée, cf figure ci-dessus) avec constitution de foyers isolés ou multiples tels ostéo-articulaire (spondylodiscites, atteinte sacro-iliaque), hépatosplénique, méningite, endocardite, ou encore orchi-épididymite.

Cliché radiologique d'une spondylodiscite
(à droite)

- Phase tertiaire (brucellose chronique ou état d'hypersensibilité) avec une expression double comme une symptomatologie générale de type asthénie et/ou polyalgies ou encore une symptomatologie plus focale par évolution torpide des foyers. La mortalité est faible (< 5%), même en l’ absence de traitement.

Symptomes et signes de la Brucellose (> 900 observations)(http://emedecine.com)

Symptômes (S)	%	Signes	%
Fièvre	98	Hépato-splénomégalie	41^a
S. généraux*	94	Hépatomégalie	38
Sueurs	85	Splénomégalie	22
Frissons	79	Ostéo-articulaires	23
Arthralgies	53	Bradycardie relative	21^b
S. gastro-intestinaux**	51^a	Adénopathie	9
Céphalées	42^a	Neurologie/SNC****	8
Douleurs lombaires	39	Orchite-épididymite	6^a
Myalgies	35	Cutanés	3^b
Tous/dypsnée	19^a
Perte pondérale	18^a
S. neurologiques***	14^a
Douleur testiculaire	5

Des foyers peuvent exister dans la faune sauvage: http://www.vet-lyon.fr/ens/faune/maladies.htm

Chez l'homme, deux espèces prédominent en France, B. melitensis et B. abortus, B. melitensis étant responsable des infections les plus graves. La brucellose humaine reste endémique dans certains pays du bassin méditerranéen, au Moyen Orient, en Asie de l’Ouest, et dans certaines régions d’ Afrique et d’ Amérique latine.

Toutefois, son incidence réelle peut être sous-évaluée. En Europe, la brucellose demeure endémique dans certains pays tels la Grèce, le Portugal ou l’ Espagne. L' Afrique du Nord et le Proche Orient sont également très concernés.

En France, le nombre de cas déclarés a été faible en 2000 et en 2001, respectivement 44 et 23, soit une fréquence respective de cas/100.000 habitants de 0,07 et 0,04. La surveillance de la brucellose (MDO) est maintenant organisée depuis fin 2002 par l’ action conjointe de l’Institut de Veille Sanitaire (InVS), du centre national de référence (CNR) des Brucella (Dr Garin-Bastuji, AFSSA), et du laboratoire associé au CNR (Pr. Maurin, CHU de Grenoble), sous la tutelle du Ministère de la Santé.

Jusqu'à très récemment, la brucellose humaine était majoritairement une maladie professionnelle, les personnes à risque sont certains professionnels, d’où une prédominance masculine.
Une étude sur 673 cas déclarés aux autorités sanitaires de 1990 à 1994 confirmait les aspects suivants:
• La brucellose est localisée au sud-est du pays, en particulier la Haute-Corse, les Hautes-Alpes, mais aussi le Cantal ........ D’ où la notion de zone montagneuse. http://www.invs.sante.fr/beh/1996/9634/

Dernier rapport : http://www.invs.sante.fr/publications/default.htm, maladies infectieuses à déclaration obligatoire, pages 199 à 201, 2003.

• Lors de contamination professionnelle, la proportion de femmes est de 15,2 % avec 50 % pour le personnel de laboratoire. Parmi les 467 cas, 1/3 des personnes exerçait une profession à risque: agriculteurs, éleveurs ou bergers, personnel des abattoirs, bouchers, transporteurs ou encore vétérinaires.
• Les modes de contamination sont variés.

• 65 % des personnes atteintes étaient de sexe masculin, 34,9 % de sexe féminin avec une moyenne d’ âge de 42 ans (+ ou - 17 ans).

• Il s’agissait de façon prédominante d’infections à B. melitensis (70% des cas), biovars 1 (Nord) et 3, et plus rarement B. abortus biovars 3 et 4 (Massif Central).

Depuis la disparition du réservoir animal en France, la brucellose humaine est une maladie d'importation touchant des populations originaires de zones d'endémie (principalement Portugal, Afrique du Nord, Moyen Orient) ou de personnes ayant visité ces régions où elles se sont contaminées (principalement par consommation de produits laitiers crus ou au contact d'animaux infectés).

L’espèce B. suis reste exceptionnelle. Elle est surtout présente en Asie et en Océanie. Ainsi des cas sporadiques sont régulièrement observés en Polynésie Française et à Wallis et Futuna où la brucellose porcine est fréquente.

Enfin B. canis (1 cas vraisemblablement importé décrit dans un chenil d'élevage en 1996 en France) et les espèces "marines" (deux cas identifiés sur les côtes françaises) n’ ont jamais été isolées chez l'homme en France.

• L’ existence de cas groupés entraîne une enquête. Brucella est considérée comme une arme biologique poitentielle avec une dissémination par aérosol, scénario le plus probable.

- PHYSIO-PATHOGENIE

Les Brucella (agent biologique de la classe 3) pénètrent l'organisme par plusieurs voies : cutanée, oculaire, digestive ou respiratoire. La voie de contamination principale est vraisemblablement digestive. Il y a pénétration à travers une muqueuse (conjonctive, pharyngée, buccale, nasale, respiratoire............ puis les bactéries gagnent par voie lymphatique, le premier relais ganglionnaire. Elles se multiplient et disséminent dans tout l'organisme par voie lymphatique et sanguine (bactériémie continue à la phase d'invasion). Ainsi après une période d’ incubation variable, de l'ordre d'une dizaine de jours, la brucellose se caractérise dans sa phase aiguë par une septicémie (stade primaire de la fièvre sudora-algique). Ces germes sont phagocytés plus ou moins rapidement par les macrophages ou monocytes, puis détruits avec libération d'antigène et d'endotoxine. Ce sont des parasites intracellulaires facultatifs du système réticulo- histocytaire (splénomégalie, hépatomégalie).

Leur S-LPS est moins toxique pour les macrophages, moins pyrogène, et moins inducteur de sécrétion d’ interféron-C et de TNF-alpha que celui des entérobactéries. Les Brucella sécrètent également un facteur empêchant l’apoptose des macrophages infectés. Leur multiplication intracellulaire a lieu dans un autophagosome, après inhibition de la fusion phagolysosomiale. Enfin l’acidification de la vacuole de phagocytose induit l’expression d’un système de sécrétion de type IV (VirB), essentiel à la virulence des Brucella dans les modèles expérimentaux cellulaires ou animaux.
- Cette phase d'invasion se manifeste aussi par une fièvre ondulante, correspondant aux décharges bactériémiques. La maladie évolue ensuite vers une phase sub-aiguë (brucellose localisée ou secondaire), avec possibilité de localisations secondaires (cf tableau pouvoir pathogène). Il y a réponse immunitaire par production d'anticorps permettant le sérodiagnostic de la maladie (sérodiagnostic de Wright). Leur rôle protecteur semble réel mais secondaire par rapport à l'immunité cellulaire.

L'immunité à médiation cellulaire est essentielle pour la défense de l'organisme contre l' infection. Les lymphocytes T renforcent l'activité bactéricide des macrophages qui détruisent les Brucella au sein d'un granulome spécifique. Leur persistance intramacrophagique entretient un état d'hypersensibilité retardée participant aux effets de la brucellose tertiaire ou chronique.

- DIAGNOSTIC CHEZ L'HOMME

Au plan hématologique, il n'y a pas de leucocytose, seule une neutropénie, plus rarement une thrombopénie pourront être rapportée. Un syndrome inflammatoire est généralement noté, en particulier une élévation de la protéine C réactive sérique. Plus rarement, une élévation des transaminases hépatiques mais modérée peut être observée. Lors d’examen du liquide articulaire (arthrite brucellienne), il est rapporté un taux élevé de leucocytes (> 10³/mm3) montrant une prédominance de polynucléaires neutrophiles. Enfin l’examen du LCR (si méningite) montre le plus souvent un liquide clair avec présence de leucocytes mais une prédominance de lymphocytes, la protéinorrachie étant élevée mais pouvant s'accompagner d’une hypoglycorrachie.

- Si le diagnostic sérologique est le plus fréquent, plus particulièrement en zone d'endémie, seul le diagnostic bactériologique par culture et isolement de la souche apportera la certitude. Les techniques d’ amplification génique (PCR) offrent de nouvelles perspectives mais sont limitées à des laboratoires spécialisés.

Prélèvements
- Forme sudoro-algique : hémocultures: la bactériémie est continue, donc prélever 3 séries/24 h
- Forme focalisée : LCR, pus, liquide articulaire, ganglion, biopsie osseuse.....

Milieux
Les mileux commerciaux actuels conviennent comme ceux d'hémoculture contenant, par ailleurs, du CO2 nécessaire pour l'isolement de certains biovars de B. abortus. D'autres milieux peuvent être ensemencés tels une gélose Columbia au sang frais ou enrichie en sérum. Il convient d'incuber à 37°C et sous C0₂ +, au moins 15 jours.

La modalité de recherche d'une Brucella selon Castaneda, (bactériologiste mexicain) consiste en ensemencer un milieu biphasique (liquide et solide) est devenue inutile. Les milieux proposés pour les automates d'hémocultures (Becton-Dickinson, bioMérieux) sont satisfaisants, la positivité s'obtenant en 3 jours, à peu près.

Hémoculture aérobie sur Bact'Alert® à droite

Morphologie : il s'agit de petits coccobacilles à Gram-négatif de 0,5-0,7 µm de longeur sur 0,6 à 1,5 µm de diamètre. Ces bactéries sont immobiles, acapsulés et asporulés.
Lors d'hémoculture positive, apparaissent souvent en amas à cause de la présence d'agglutinines sériques (voir à droite)

Caractères de culture : Les Brucella poussent pauvrement et lentement sur les milieux habituels tels milieux pour hémoculture ou gélose chocolat à 37°C et en présence ou non de CO2. Car certaines espèces et biotypes sont exigeantes en gaz carbonique (CO₂)(en particulier B. abortus).

Identification antigénique

L'agglutination sera de type rapide sur lame avec un immunsérum monospécifique anti-Brucella melitensis et/ou anti-Brucella abortus. Ces bactéries étant sensibles à la chaleur en milieu liquide, une ébullition de quelques minutes à 85°C suffiront pour préparer la suspension antigénique de la souche à agglutiner.

Un dernier élément d'orientation rapide sera d'observer attentivement la sensibilité importante à deux antibiotiques : les tétracyclines (TET) et la rifampicine (RIF) sur l'antibiogramme obtenu sur le milieu de Mueller-Hinton normal (cf à droite).

Le diagnostic de genre Brucella est donc rapidement obtenu mais le diagnostic bactériologique en espèce et biovar réservé à quelques laboratoires a un intérêt épidémiologique.

En raison de sa difficulté et des risques de contamination humaine, ce diagnostic est maintenant réservé à des laboratoires spécialisés comme le Centre National de Référence de création récente (AFSSA): http://www.invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste_cnr.htm

Il conviendra de faire une demande d'envoi d'échantillon

NE PAS OUBLIER DE FAIRE LA DECLARATION (MDO)
http://www.invs.sante.fr/surveillance/mdo/fiches/fiche_brucellose.pdf

Parmi les autres épreuves d'identification (dites de Huddleson) peuvent être recherchées la production de H2S, la croissance ou non sur des milieux gélosés contenant des concentrations variables de colorants inhibiteurs tels thionine (T), fuchsine basique (F).

Ces déterminations doivent être effectuées comparativement avec des espèces et biovars de référence.

Exemple: Aspects de culture de B. abortus, biovars 1, 2, 3, 4 et 9 en présence de 20 µg/ml de F (à gauche) et T (à droite)

DIAGNOSTIC GENOMIQUE

Malgré la création récente d'un CNR, les difficultés d'envoi de la souche peuvent amener le biologiste hospitalier à effectuer en urgence, une amplification (PCR) par exemple de la IS 711.

Compte tenu de la rareté actuelle d'isolement de souche en médecine humaine en France, une amplification du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S sera plus facile à obtenir, suivie d'un séquencage. En fait, celui-ci confirmera rapidement qu'il s'agit d'une bactérie du genre Brucella.

La différenciation des espèces impliquées, voire de certains biovars, peut être obtenue par analyse de profil de restriction en champ pulsé du génome bactérien, ou mieux par amplification de certains gènes suivie ou non d'une restriction comme montré ci-dessous, ou encore par la technique d’ amplification–hybridation (AMOS PCR). Ces techniques restent très spécialisées.

Identification moléculaire de B. abortus (A) après PCR du gène omp31 M, B. melitensis; S, B. suis	Identification moléculaire de Brucella après PCR du gène omp25 et restriction (B)(EcoRV) ou non (A) A, B. abortus; M, B. melitensis; O, B. ovis
cliché INRA-Nouzilly	cliché INRA-Nouzilly

* Dans l'exemple d' identification moléculaire de droite, B. ovis est identifié à cause d'une délétion du gène omp25 (38 bp) et B. melitensis par son absence d'un site de restriction EcoRV.

- DIAGNOSTIC INDIRECT

Sérodiagnostic
Le diagnostic indirect de la brucellose, plus souvent évoqué dans certaines zones, peut faire appel à plusieurs techniques sérologiques dont la sensibilité et la spécificité varient. Le problème essentiel reste la possibilité d'un faux positif, en particulier lors d'infection à Yersinia enterocolitica sérovar O9.

* La séroagglutination lente en tube ou sérodiagnostic de Wright est la plus ancienne technique étalonnée au plan international (réponse en Unités Internationales possible). elle fait appel à une suspension de germes en phase lisse tués.
Les agglutinines apparaissent dès le 10e jour de la maladie (IgM), puis suivent une cinétique passant par un optimum, puis il y a décroissance jusqu'au 5-8e mois d'évolution. L'intérêt de cette technique se situe au stade de la brucellose aiguë et sub-aiguë. Un titre positif correspond à une agglutination complète au 1/80e (100 UI). Lors de doute, une autre sérologie sera prescrite 1 à 2 semaines plus tard.

3 - Une sérologie positive doit tenir de l'éventuelle manque de spécificité. Il conviendra, ainsi, de rechercher une éventuelle infection à Y. enterocolitica 09, une tularémie, ou encore une éventuelle vaccination à V. cholerae ....

** Epreuve à l'antigène tamponné (EAT), dénommé aussi test au rose Bengale. Il s'agit d'une variante d'agglutination rapide sur lame avec le sérum non dilué. L'interprétation est similaire à celle de l'agglutination lente en tubes mais la cinétique des anticorps est décalée (IgG détectés) et plus longue que celle du sérodiagnostic de Wright.

*** Les autres épreuves sérologiques tiendront compte du stade d'évolution dela maladie tels brucellose sub-aiguë ou chronique et de la sensibilité respective des techniques sérologiques comme immunofluorescence indirecte, test de Coombs, déviation ou fixation du complément, ELISA et enfin de la cinétique des anticorps.

Dans tous les cas de suspicion, il convient d'adresser le sérum au CNR-Laboratoire associé (CHU Grenoble – Pr Maurin)

- Diagnostic allergique
il s'agissait de détecter un état d'hypersensibilité qui apparait précosément (15 jours) en effectuant au niveau du bras, d'une intradermo-réaction à la mélitine (Burnet) : Cette épreuve d'hypersensibilité retardée est peu utilisée en l'absence actuelle d'allergène facilement disponible dans le commerce. La réaction est précoce (lecture après 24 h d'une réaction locale et quelquefois générale). La réaction positive se caractérise par l'apparition d'un oedème, d'un érythème. Enfin l'état allergique montre une longue persistance.

- DIAGNOSTIC CHEZ L'ANIMAL :

Diagnostic direct

La méthode la plus fiable de diagnostic de la brucellose animale demeure l’isolement de l’agent en cause. L’examen microscopique de frottis d’écouvillons vaginaux ou de placentas ou fœtus après coloration de Stamp constitue une méthode rapide de dépistage. Néanmoins, d’autres micro-organismes tels que Brucella ovis, Chlamydophila abortus (agent de la Chlamydiose) ou Coxiella burnetii (agent de la fièvre Q) peuvent être confondus avec Brucella par cette méthode qui s’avère également peu sensible.

La recherche de Brucella par culture est donc très fortementre commandée. Les prélèvements de choix sur l’animal vivant sont les sécrétions génitales (écouvillonnage vaginal en zone péri-cervicale) et le lait, l’excrétion mammaire et génitale étant généralement prolongées dans ces espèces. L’avorton (contenu stomacal, poumon et rate) et les annexes placentaires constituent également un prélèvement potentiellement intéressant et sont généralement riches en Brucella. Ils sont néanmoins souvent contaminés par la flore de l’environnement et surtout dangereux tant pour le préleveur que pour le personnel chargé du transport et celui du laboratoire de diagnostic. Sur la carcasse, outre les testicules en cas d’orchite chez le mâle, la rate et les ganglions lymphatiques (rétro-mammaire, parotidien, mandibulaire et rétro-pharyngien voire les ganglions iliaques) représentent les prélèvements les plus intéressants.

Au laboratoire, les recherches s’effectuent sur milieu sélectif de Farrell qui peut être complété pour plus de sensibilité par le milieu de Thayer-Martin. La sensibilité de la bactériologie reste néanmoins limitée, et les prélèvements et ensemencements doivent parfois être multipliés pour mettre en évidence la bactérie. Ceci est particulièrement vrai chez les animaux préalablement vaccinés. La méthode PCR développée depuis une dizaine d’années reste encore peu sensible (y compris la double amplification) et son intérêt réside surtout dans sa capacité de détection de bactéries tuées ou dans des prélèvements très contaminés par la flore annexe. Elle est actuellement considérée comme un bon complément de la bactériologie classique mais ne peut aucunement la remplacer.

Dépistage - Diagnostic indirect

Epreuves sérologiques
Le LPS-S constitue l’antigène majeur des Brucella en phase lisse et la majorité des anticorps produits chez l’hôte infecté sont spécifiques d’épitopes portés par cette molécule. L’épreuve à l’antigène tamponné (EAT ou Rose Bengale) et celle de Fixation du complément (FC) sont de longue date celles les plus employées pour le dépistage de la brucellose animale. Epreuves officielles tant au plan international qu’européen, ce sont aussi les épreuves standardisées les plus fiables aujourd’hui pour le dépistage de la brucellose à B. abortus, B. melitensis ou B. suis.

- L’ EAT est une épreuve très sensible, détectant précocement l’infection mais qui présente quelques défauts de spécificité (faux positifs en cheptel indemne, surtout chez le porc). Ces propriétés en font une excellente méthode de surveillance compte tenu de sa capacité à la détection des cheptels infectés.

- La FC est quant à elle plus spécifique (moins de faux positifs), plus tardive et, d’une façon générale, légèrement moins sensible que l’ EAT (plus de faux négatifs en cheptel infecté). L’utilisation conjointe des deux épreuves permet donc d’accroître la sensibilité du dépistage et d’assainir plus efficacement les cheptels infectés, si l’abattage concerne l’ensemble des animaux positifs à l’une au moins des deux épreuves.
Cependant, la très faible prévalence de l’infection s’accompagne obligatoirement d’une proportion importante de résultats faussement positifs. Du fait de leurs spécificités respectives, ce phénomène concerne davantage l’ EAT que la FC. Ces résultats faux positifs sont aujourd’hui fréquemment liés à des infections par des micro-organismes croisant au plan antigénique avec les Brucella, Yersinia enterocolitica O: 9 surtout. Ces réactions sont généralement fugaces et concernent un nombre souvent très réduit d’animaux dans le cheptel.

- L’ ELISA indirect a, quant à lui, fait l’objet de nombreux travaux ces vingt dernières années. Très sensible, il semble moins spécifique que les deux précédentes épreuves. Sauf chez les bovins, il ne fait par ailleurs pas encore l’objet d’une standardisation internationale et n’est donc pas reconnu comme test officiel. Chez les bovins, le Ring-test et l' ELISA sont également utilisables sur le lait de tank des exploitations pour la surveillance des cheptels.

Epreuves d’immunité cellulaire
- L’ épreuve cutanée allergique à la brucelline, validée chez les bovins, a été peu évaluée chez les porcins, les ovins et les caprins. Le brucellergène (ND, Synbiotics, France) est actuellement le seul produit commercial dépourvu de LPS-S et donc utilisable sans risque d’induction d’anticorps ou de réaction inflammatoire pouvant interférer avec le diagnostic. Cette épreuve est très sensible et très spécifique, mais une vaccination préalable, y compris par voie conjonctivale, est susceptible d’induire des réactions positives pendant longtemps chez certains animaux. Elle est essentiellement utilisée en Europe comme méthode de confirmation/infirmation de la sérologie, lorsqu'on craint des réactions croisées dues à Yersinia.

- SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES - TRAITEMENT

- L'antibiogramme pourra être limité à quelques antibiotiques tels ß-lactamines (aminopénicillines céphalosporines de troisième génération avec céfotaxime et ceftriaxone, imipénème), macrolides (azithromycine avec une CMI 90% variant de 0,5 à 2 mg/l), aminosides (streptomycine, gentamicine ou GM), tétracyclines (TET, TE, MNO) rifampicine (RIF, RA), et fluoroquinolones. Seuls les aminosides, les tétracyclines et la rifampicine montrent une activité bactéricide. La résistance acquise est rare.

* Enfin l'antibiogramme peut avoir un intérêt taxonomique, il sera effectué sur le milieu de Mueller-Hinton normal ou, souvent en routine, sur celui enrichi (sang cuit).

- Le traitement d'une brucellose prendra en considération qu'il s'agit de bactéries intracellulaires facultatives et le stade de la maladie. Aussi si les Brucella sont sensibles in vitro à de nombreux antibiotiques telles ß-lactamines, on aura, à l'esprit, les études concernant l’activité intracellulaire des antibiotiques : faible pour la streptomycine, importante et bactéricide pour la rifampicine. A pH acide, seule la rifampicine et la doxycycline conservent une activité bactériostatique alors que la streptomycine et les fluoroquinolones sont inactivées. Or, ces bactéries se multiplient à l‘intérieur de phagosomes acides. Les modèles animaux testés depuis longtemps (souris, cobaye) ont confirmé l'efficacité des aminosides (streptomycine), des tétracyclines
et de la rifampicine, de même que la supériorité d'une association par rapport à la monothérapie. Ainsi les fluoroquinolones sont inactives en monothérapie chez l’animal.

* Le premier protocole thérapeutique de la brucellose aiguë non focalisée, préconisé en 1965 par l’OMS, proposait l’association de la tétracycline (500 mg/4 fois/jour per os, 4-6 semaines) à la streptomycine (1 g/jour en injection intramusculaire ou IM, pendant les deux premières semaines). L'OMS a proposé comme alternative, l’association de la doxycycline (200 mg/jour) à la rifampicine (600 à 900 mg/jour) pendant 6 semaines. Cependant, la durée de traitement doit être supérieure lors de localisation ostéo-articulaire.
Enfin la gentamicine à la dose de 5 mg/kg/jour, en une injection quotidienne pendant 7 à 10 jours est une alternative à la streptomycine. Récemment, l’association d’une fluoroquinolone à la rifampicine s’est avérée aussi efficace que celle avec la doxycycline.
Chez l’enfant de moins de 8 ans, le cotrimoxazole à la dose de 80 mg/kg en 2 fois /jour pendant 45 jours sera associé à la streptomycine (30 mg/kg 1 fois/j) pendant 21 jours ou à la gentamicine (5 mg/kg/jour, IM en 1 fois/jour) pendant 7 jours ou encore à la rifampicine (15 mg/kg/jour). Ce dernier antibiotique pourra être proposé en association avec la streptomycine.
Chez la femme enceinte, le cotrimoxazole seul ou en association avec la rifampicine sera prescrit.
Lors de brucellose focalisée, les mêmes associations seront prescrites pour des durées de traitement plus grandes, de 2 - 3 mois minimum à 6 mois. Au cours de l’ endocardite, la durée minimale sera de 8 semaines mais un traitement chirurgical du foyer infectieux (remplacement valvulaire) sera parfois nécessaire, associé au traitement médical.

Prophylaxie animale : La réglementation de la brucellose des animaux domestiques met en oeuvre des mesures sanitaires (dépistage et abattage des animaux infectés).

http://www.aphis.usda.gov/vs/nahps/brucellosis/

Prophylaxie humaine :
La prophylaxie de la maladie humaine passe nécessairement par celle de la maladie animale. Parmi les autres mesures, celles hygiéniques comme la protection par gants, lunettes de certaines professions exposées est bien connue. Les autres mesures concernent le traitement thermique de certaines denrées alimentaires. Les vaccins proposés par le passé n'ont plus d' intérêt.
Enfin l’administration prophylactique de tétracycline seule a été proposée lors d’ exposition vaccinale accidentelle (éleveurs, vétérinaires). Celle de l' association doxycycline (200 mg/j) - rifampicine (600 mg/j) pendant 3 semaines peut être recommandée lors d’exposition accidentelle du personnel de laboratoire.Un suivi sérologique est recommandé (3 mois minimum).

Quelques adresses:
http://www.invs.sante.fr/surveillance/brucellose/default.htm
http://www.chu-rouen.fr/ssf/organ/brucella.html
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/brucellosis_g.htm
http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss/msds23f.html
http://www.sante.gouv.fr
http://www.liste-hygiene.org/arcbrucellose.htm
http://www.vet-alfort.fr/ENSV/brucellose-2004.pdf
http://www.oie.int/search/search.asp
http://www.pasteur.fr/sante/clre/chap/envois/frame-a.html
www.pathexo.fr/pdf/2001n2/SMV.pdf
http://www.the-icsp.org/subcoms/brucella.htm

Revue générale récente: M. Maurin. La brucellose à l’ aube du 21e siècle. Médecine et maladies infectieuses, 2005; 35: 6–16