I - Objet

II - Réactifs

III - Méthodologie

IV - Lecture des lames

V - Notation des résultats

VI - Annexes

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 I - Objet

Ce document détaille les protocoles de coloration et d'examen microscopique des frottis colorés pour la recherche et l'observation des mycobactéries.

 

II - Réactifs

Se reporter en annexes du document.

 

III - Méthodologie

A - Préparation des frottis

B - Fixation

C - Colorations

1 - Méthodes utilisant la fuchsine

2 - Méthodes utilisant l'auramine

3 - Méthode utilisant l'acridine orange

 

A - Préparation des frottis

- Graver au diamant sur la lame le N° du prélèvement correspondant.

- A partir du prélèvement (parcelle purulente si possible), faire un frottis fin sur les 2/3 de la lame (un frottis fin permet de voir à travers les lettres noires d'une page imprimée); trop épais le frottis se décolle.

- A partir du culot de centrifugation, faire un frottis sur une surface de 1 x 2 cm.

 

NB : Si le frottis est fait à partir du flacon Bactec 12B, 0,1 ml de culot est ajouté à 0,1 ml de sérum de lapin.

 

B - Fixation

- Laisser sécher le frottis (à l'air ou sur une plaque chauffante à température moyenne).

- Fixer à l'alcool méthylique.

 

C - Colorations

Plusieurs techniques sont utilisées pour colorer les mycobactéries présentes dans les prélèvements :

1 - Méthodes utilisant la fuchsine

2 - Méthodes utilisant l'auramine

3 - Méthode utilisant l'acridine orange

 

Remarques :

Pour toutes les colorations , le rincage à l'eau se fait sous un filet d'eau de robinet.

Le séchage entre 2 épaisseurs de papier filtre est à éviter.

 

1 - Méthodes utilisant la fuchsine

 

1.1 - Coloration de Ziehl-Neelsen à chaud

Réactifs

Fuchsine de Ziehl (RAL)

Acide nitrique au 1/5

Alcool à 95°

Bleu de méthylène

Technique

- Couvrir la lame de fuchsine phéniquée.

- Chauffer trois fois en 10 minutes jusqu'à émission de vapeurs

(le colorant ne doit pas bouillir ou se déssécher sur la lame; en ajouter si nécessaire).

- Rincer à l'eau.

- Couvrir la lame d'acide nitrique dilué au 1/3. Laisser agir 45 secondes.

- Rincer à l'eau.

- Couvrir la lame d'alcool éthylique à 95°. Laisser agir 5 mn.

- Rincer à l'eau

- Recouvrir la lame de bleu de méthylène. Laisser agir 2 mn.

- Rincer à l'eau.

- Laisser sécher à l'air libre.

 

Remarques

* La coloration de Ziehl-Neelsen peut être faite à froid. Les lames sont immergées pendant au moins 3 heures dans la solution de fuchsine.

* On peut utiliser l'acide sulfurique dilué au 1/4 à la place de l'acide nitrique.

* On peut avantageusement remplacer les deux temps de la décoloration par l'utilisation d'un mélange acide-alcool que l'on laissera agir pendant 2 minutes.

* Le réactif d'Armand qui contient l'acide, l'alcool, et le bleu de méthylène permet de réaliser en un seul temps la décoloration et la recoloration des frottis préalablement colorés par la fuchsine.

 

 1.2 - Coloration de Kinyoun

Réactifs

Fuchsine basique

Décolorant

Bleu de méthylène

Technique

- Couvrir la lame avec la fuchsine. Laisser 5 mn à froid sans chauffer.

- Rincer à l'eau.

- Couvrir la lame avec la solution acide alcool pendant 2 mn.

- Rincer.

- Couvrir la lame de bleu de méthylène. Laisser agir 2 mn.

- Rincer à l'eau.

- Laisser sécher à l'air.

 

 

2 - Méthode utilisant l'auramine

 

Coloration de Degommier

 Réactifs

Acide trichloracétique 1 %

Auramine 00

Décolorant

Rouge de thiazine

Technique

- Couvrir la lame d'acide trichloracétique à 1% pendant 30 mn.

- Rincer à l'eau.

- Couvrir la lame avec la solution d'auramine pendant 15 mn.

- Rincer à l'eau.

- Couvrir la lame avec la solution décolorante pendant 2 mn.

- Rincer à l'eau.

- Couvrir le frottis avec la solution de rouge thiazine pendant 1 mn 30.

- Rincer à l'eau.

- Décolorer avec la solution décolorante pendant 3 mn.

- Rincer à l'eau.

- Sécher à l'air.

 

3 - Méthode utilisant l'orange acridine

 

Réactifs

Orange acridine

Décolorant

Bleu de méthylène

 

Technique

- Couvrir la lame avec la solution d'acridine orange à 1% pendant 15 mn.

- Rincer à l'eau.

- Couvrir la lame avec la solution de décoloration pendant 1 mn.

- Rincer à l'eau.

- Couvrir le frottis de bleu de méthylène pendant 1 mn.

- Rincer à l'eau.

- Décolorer avec la solution décolorante pendant 3 mn.

- Rincer à l'eau.

- Sécher à l'air.

 

 

IV - Lecture des lames

 

1 - Lecture des lames colorées à la fuschine

2 - Lecture des lames colorées à l'auramine

3 - Lecture des lames colorées à l'orange acridine

 

 

1 - Lecture des lames colorées à la fuschine

La lecture microscopique des lames colorées à la fuchsine par la méthode de Ziehl-Neelsen ou par la méthode de Kinyoun se fait à l'immersion objectif 100 x et avec des oculaires de 10. C'est-à-dire grossissement final de 1000.

Il faut examiner au moins 100 champs, ce qui requiert environ 15 minutes avant de déclarer une lame négative.

Trois balayages du frottis doivent être réalisés.

 

 

 

Les Bacilles Acido-Alcoolo Résistants (B.A.A.R.) apparaissent rose sur fond bleu. Ils sont droits ou légèrement incurvés de 2 à 4 µm sur 0.3 à 0.5 µm de large. Ils sont souvent granuleux et groupés en amas.

A l'examen microscopique des frottis réalisés à partir de colonies, les bacilles peuvent apparaitre colorés en bleu. Ces cultures sont soit trop jeunes, soit trop vieilles. Des formes coccoïdes ou filamenteuses peuvent s'observer.

La réponse doit toujours être faite en terme de présence ou absence de B.A.A.R et non en terme de bacilles tuberculeux, de bacilles lépreux, ou de toute autre espèce mycobactérienne.

 

 

2 - Lecture des lames colorées à l'auramine

Lire les lames au microscope à fluorescence, à l'objectif à sec métallographique 25 x pour un dépistage rapide, et à l'objectif 40 x pour confirmation.

Il faut lire au moins 30 champs par lame avant de déclarer une lame négative.

Les mycobactéries apparaissent jaune fluorescentes sur fond rouge. Pour des cas particuliers, la coloration de Ziehl peut se faire par surcoloration d'une lame déja colorée à l'auramine.

 

 

3 - Lecture des lames colorées à l'orange acridine

Lire les lames au microscope à fluorescence à l'objectif 40 x. Il faut lire environ 70 champs par lame avant de déclarer une lame négative.

Les mycobactéries présentent une fluorescence rouge à orange.

 

 

V - Notation des résultats

 

Nombre de BAAR	Répondre
< 1 / 100 champs	Négatif
1-9 / 100 champs	1 + examen suspect à confirmer
10-99 / 100 champs	2 +
1-9 / champ	3 +
10-99 / champ	4 +
>100 / champ	5 +

Expression des résultats de l'examen microscopique selon le nombre de bacilles observés par champ microscopique au grossissement 1000. Propositions de l'OMS.

 

 

 

 

VI - Annexes

 

1 - Coloration de Ziehl Neelsen (à chaud)

2 - Coloration de Kinyoun modifiée (à froid)  

3 - Coloration à l'auramine

4 - Coloration à l'Orange acridine

 

1 - Coloration de Ziehl Neelsen (à chaud)

Fuschine de Ziehl (RAL)

Fuchsine basique RAL pour Bactériologie ................10 g

Phénol 55 g .......................................................................55 g

Alcool à 90° ......................................................................100 ml

Eau distillée ......................................................................1000 ml

Verser les 100 ml d'alcool dans un mortier de 2 litres. Ajouter la totalité du colorant en broyant au fur et à mesure, puis peu à peu, l'acide phénique en triturant. Verser le mélange dans un flacon de verre teinté. Rincer le mortier avec de l'eau distillée, plusieurs fois dans le flacon jusqu'à concurrence de 1 litre.

Laisser reposer 24 heures à l'étuve à 37°C. Filtrer sur papier.

 

Décolorant

Acide sulfurique...................................................................100 ml

Eau distillée........................................................................ 300 ml

Verser toujours l'acide très lentement dans l'eau.

 

Bleu de méthylène

Bleu de méthylène .............................................................. 1 g

Alcool à 95°...................................................................... 10 ml

Phénol................................................................................ 1 g

Eau distillée........................................................................ 100 ml

Même préparation que ci-dessus

 

Tous les réactifs se conservent à température ambiante pendant une longue durée.

 

 

2 - Coloration de Kinyoun modifiée (à froid)

 Fuschine phéniquée de Kinyoun

Fuchsine basique RAL pour Bactériologie .................................... 4 g

Solution aqueuse de phénol à 8% .....................................................50 g

Alcool à 95 %........................................................................................ 20 ml

Dissoudre la fuschine dans les 20 ml d'alcool à 95% puis ajouter les 100 ml de la solution aqueuse de phénol*.

*Chauffer doucement le flacon de phénol au bain-marie. Mesurer dans une éprouvette graduée ou avec une pipette munie d'une poire, le volume nécessaire de phénol. Le mettre dans le flacon contenant le volume d'eau nécessaire, placé également au bain-marie (l'éprouvette ou la pipette doit être mise préalablement réchauffée par passage au bain-marie).

 

Décolorant

Acide chlorhydrique....................................................................... 3 ml

Alcool à 95 %................................................................................ 97 ml

 

Bleu de méthylène

Bleu de méthylène ......................................................................... 0,3 g

Eau distillée................................................................................... 100 ml

Tous ces réactifs se conservent à température ambiante pendant une longue durée

 

 3 - Coloration à l'auramine

Acide trichloracétique à 1 %

Acide trichloracétique*........................................................ 10 g

Eau distillée............................................................................ 1000 ml

Dissoudre lentement l'acide dans l'eau.

 

Auramine

Auramine 00.......................................................................... 1 g

Phénol..................................................................................... 50 g

Chlorure de magnésium..................................................... 100 ml

Eau distillée (tiède)............................................................... qsp 1000 ml

 

Peser 1 g d'auramine, verser la poudre dans un ballon de 1 litre contenant 500 ml d'eau distillée, bien mélanger,

Mettre à l'étuve pendant 24 heures.

Dissoudre 50 g de phénol dans 100 ml de la solution de chlorure de magnésium à 2 %.

Mélanger les 2 solutions. Compléter à 1000 ml avec de l'eau distillée.

Filtrer avec 2 filtres.

Conserver à l'obscurité et à + 4° pendant une durée maxima de 1 mois.

 

Décolorant

Alcool à 95 %...................................................................... 935 ml

Eau distillée........................................................................... 65 ml

Acide chlorhydrique pur.......................................................... 5 ml

Chlorure de sodium .................................................................5 g

 

Solution de rouge thiazine

Rouge de thiazine .....................................................................1 g

Chlorure de magnésium à 2 % ..................................................100 ml

Phénol .....................................................................................50 g

Eau distillée qsp. ......................................................................1000 ml

Mode de préparation identique à celui de l'auramine.

 

 

4 - Coloration à l'Orange acridine

Colorant orange acridine

Mesurer dans l'ordre et mettre dans un erlen de 6 litres :

Glycérol .....................................................................................1250 ml

Ethanol .......................................................................................1235 ml

Eau distillée .................................................................................2500 ml

 

Ajouter ensuite 250 g de phénol.*

Reprendre un flacon d'orange acridine (5 g) dans 20 ml d'éthanol et verser la solution ainsi préparée dans l'erlen (pour une meilleure dissolution et récupération de la poudre orange acridine, il est préférable de reprendre le flacon avec 5 ml d'éthanol à chaque fois, et de renouveller l'opération 4 fois de suite).

Transférer un barreau magnétique dans l'erlen. Boucher l'erlen avec du film recouvrant, entourer l'erlen de papier aluminium et mettre en route l'agitation pendant une nuit.

Filtrer le lendemain et conserver en flacons opaques.

 

Décolorant

Ethanol ................................................................................. 3700 ml

Eau distillée ........................................................................... 1300 ml

 

Mesurer et rajouter à la solution précédente :

Acide chlorhydrique à 35 % ...............................................25 ml

Contre colorant .......................................................................25 ml

 

Bleu de méthylène

Eau distillée .............................................................................1300 ml

Bleu de méthylène .................................................................10 g

Ethanol à 95°........................................................................... 3700 ml

Transférer un barreau magnétique dans l'erlen. Boucher l'erlen avec du film recouvrant, mettre en route l'agitation pendant une nuit.

 

Remarques

*Le phénol, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, et l'acide trichloracétique sont des produits "corrosifs".

L'auramine et l'orange acidine étant des produits toxiques par inhalation et par contact, pour peser la poudre d'auramine ou d'orange acridine, le manipulateur doit porter des gants et un masque à haute filtration. Cette manipulation devrait se faire sous hotte à charbon actif.

L'évacuation des colorants doit s'effectuer selon une procédure particulière

Si les lames sont colorées dans des bacs, changer régulièrement les solutions (toutes les semaines) ou plus selon le nombre de lames colorées.