Sommaire

 

I - Objet

II - Matériel

III - Réactifs

IV - Méthodologie

1 - Décontamination à la soude à 4 % (méthode de Petroff).

2 - Décontamination à l'acétyl cystéine et à la soude (méthode de Kubica).

3 - Décontamination au lauryl sulfate de sodium (méthode de Tacquet-Tison).

4 - Décontamination à l'acide sulfurique à 4 % (méthode de Löwenstein).

V - Annexes

1 - Décontamination par la méthode à la soude à 4 %

2- Décontamination par la méthode de Kubica à l'acétyl cystéine et à la soude

3 - Décontamination par la méthode du lauryl-sulfate de sodium

4 - Décontamination par la méthode à l'acide sulfurique à 4 %

5 - Préparation du tampon phosphate 0,067 M pH 6,8

 

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I - Objet

Ce document détaille les protocoles de décontamination des prélèvements contaminés par la flore commensale. C'est une étape préalable indispensable à la mise en culture des mycobactéries.

 

II - Matériel

- Tubes coniques de 50 ml

- Agitateur mécanique de Kahn

- Centrifugeuse, éventuellement réfrigérée avec nacelles étanches

- Vortex ®

- Pipettes

 

III - Réactifs

Les modalités de la préparation des solutions de décontamination et de neutralisation des échantillons utilisées pour chaque méthode se trouvent détaillées en annexe du document.

 

IV - Méthodologie

De nombreuses méthodes de décontamination fluidification ont été décrites. Parmi celles-ci, quatre sont plus fréquemment utilisées, il s'agit :

1 - Décontamination à la soude à 4 % (méthode de Petroff).

2 - Décontamination à l'acétyl cystéine et à la soude (méthode de Kubica).

3 - Décontamination au lauryl sulfate de sodium (méthode de Tacquet-Tison).

4 - Décontamination à l'acide sulfurique à 4 % (méthode de Löwenstein).

 

Ces méthodes font intervenir plusieurs étapes. D'abord une étape de décontamination, fluidification des échantillons, suivie d'une étape de neutralisation et enfin la récupération du culot de centrifugation.

. Tous les prélèvements provenant de lésions ouvertes (respiratoires, urinaires, selles, fistules...) subissent une décontamination.

. Tous les prélèvements provenant de lésions fermées (LCR, liquides de séreuses, pus...) sont ensemencés directement.

 

1 - Décontamination à la soude à 4 % (méthode de Petroff)

Dans un tube à centrifuger conique :

- Ajouter au produit pathologique un volume égal de solution décontaminante.

- Agiter à l'agitateur de Kahn pendant 20 mn.

- Neutraliser avec la solution neutralisante jusqu'au virage du rose à violet rose.

- Centrifuger 15 mn à 3000 g.

- Jeter le surnageant et reprendre le culot dans 1 ml de tampon phosphate.

 

2 - Décontamination utilisant l'acétyl cystéine et la soude (méthode de Kubica)

Dans un tube à centrifuger conique :

- Ajouter à 3 ml de produit pathologique, 4 ml de solution décontaminante.

- Mélanger par agitation au vortex pendant 20 secondes, retourner le tube afin de parfaire le contact.

- Laisser en contact 20 mn à température ambiante en agitant doucement sur agitateur de Kahn.

- Ajouter le tampon phosphate jusqu'à 50 ml.

- Centrifuger 30 mn à 3000 g.

- Jeter le surnageant et reprendre le culot avec 1 ml de tampon phosphate.

 

 3 - Décontamination au lauryl sulfate de sodium (méthode de Tacquet-Tison)

Cette méthode ne peut être utilisée qu'avec les milieux de culture à l'oeuf et pour les méthodes de biologie moléculaire.

 

Dans un tube à centrifuger conique :

- Ajouter à 2 ml de produit pathologique, 3 ml de solution décontaminante.

- Agiter à l'agitateur de Kahn pendant 30 à 45 mn.

- Neutraliser avec la solution neutralisante jusqu'au virage au jaune.

- Centrifuger 30 mn à 3000 g.

- Jeter le surnageant et reprendre le culot avec 1 ml de tampon phosphate.

 

4 - Décontamination à l'acide sulfurique à 4 % (méthode de Löwenstein)

Cette méthode est recommandée pour la décontamination des biopsies et des pièces anatomiques ou des prélèvements très contaminés.

Dans un tube à centrifuger conique :

- Au produit pathologique, ajouter un égal volume d'acide sulfurique à 4 %.

- Mélanger au vortex et laisser incuber 15 mn à température ambiante.

- Compléter à 50 ml avec de l'eau distillée stérile.

- Centrifuger 15 mn à 3000 g.

- Jeter le surnageant.

- Ajouter une goutte de rouge de phénol et neutraliser avec de la soude à 4 % jusqu'à l'apparition d'une couleur rose pâle.

 

 

 

 

V - Annexes

 

1 - Décontamination par la méthode à la soude à 4 %

2- Décontamination par la méthode de Kubica à l'acétyl cystéine et à la soude

3 - Décontamination par la méthode du lauryl-sulfate de sodium

4 - Décontamination par la méthode à l'acide sulfurique à 4 %

5 - Préparation du tampon phosphate 0,067 M pH 6,8

 

 

 

1 - Décontamination par la méthode à la soude à 4 %

1) Solution décontaminante

Hydroxyde de potassium .................................................... 4 g

Hydroxyde de sodium .......................................................... 80 g

Eau distillée q.s.p. .................................................................. 2000 ml

 

2) Solution neutralisante

Solution mère de tournesol^V.................................................... 9 ml

Acide chlorhydrique ................................................................. 180 ml

Eau distillée q.s.p. ...................................................................... 1000 ml

 

^V Solution mère de tournesol (Subra)

Tournesol ..................................................................................... 2 g

Eau distillée ................................................................................. 100 ml

Faire dissoudre sur l'agitateur magnétique.

 

Mettre la solution mère de tournesol dans un ballon de 2 litres. Ajouter l'eau distillée, puis l'acide chlorhydrique, compléter avec l'eau q.s.p. 1 litre. Bien mélanger.

 

2 - Décontamination par la méthode de Kubica à l'acétyl cystéine et à la soude.

 

1) Préparation de la solution n° 1 = citrate de sodium

Citrate trisodique, 3 H20................................. 29,4 g

Eau distillée q.s.p.............................................. 1000 ml

Répartir en flacons de 50 ml.

Stériliser à l'autoclave 10 mn à 120°C.

Conserver à T° ambiante.

 

2) Préparation de la solution n° 2 = soude à 4 %

Hydroxyde de sodium en pastilles.................40 g

Eau distillée q.s.p...............................................1000 ml

Répartir en flacons de 50 ml.

Autoclaver.

Conserver à T° ambiante.

 

Mélanger 50 ml de chaque solution 1 et 2 dans un flacon stérile, et conserver à T° ambiante.

 

3) Préparation de la solution de N-acétyl cystéine

Solution de N-acétyl - cystéine.........................0,5 g

Mélange des solutions 1+2...............................100 ml

Filtrer.

 

ATTENTION : Le mélange final doit être réalisé tous les jours, car le réactif ne se conserve pas.

 

 

3 - Décontamination par la méthode du lauryl-sulfate de sodium

 

1) Préparation de la solution décontaminante

Lauryl - sulfate de sodium pur ............................ 30 g

Hydroxyde de sodium pur en pastilles............... 10 g

Eau distillée q.s.p ................................................... 1000 ml

Dissoudre le lauryl sulfate de sodium dans de l'eau chaude stérile et, après dissolution, ajouter l'hydroxyde de sodium. Répartir dans un flacon de volume déterminé en fonction de la consommation journalière. Maintenir le flacon à 37° C.

 

2) Solution neutralisante

Pourpre de bromocrésol en solution dans l'eau à 0,4 %.2 ml

Filtrer

Acide phosphorique pur........................................... 2 ml

Eau distillée q.s.p ...................................................... 1000 ml

Répartir en flacons unitaires de 50 ml à raison de 30 ml par flacon. Stériliser à l'autoclave 120° pendant 20 mn. On utilisera un flacon par prélèvement.

 

3) Contrôle de la solution neutralisante (à chaque fabrication)

Dans un pot conique :

A 3 ml de solution décontaminante, ajouter la solution neutralisante jusqu'au virage au jaune le volume ajouté doit être égal à 30 +/- 1 ml.

 

 

4 - Décontamination par la méthode à l'acide sulfurique à 4 %

 

1) Solution décontaminante

Solution d'acide sulfurique concentré................................... 40 ml

Eau distillée ............................................................................... 960 ml

Verser doucement l'acide dans l'eau.

 

2) Solution neutralisante

Rouge de phénol ....................................................................... 80 mg

Hydroxyde de sodium à 4 %^V .............................................. 20 ml

Eau distillée stérile qsp .............................................................1000 ml

 

^V Solution d'hydroxyde de sodium à 4 %

Hydroxyde de sodium ............................................................. 4 g

Eau distillée .................................................................................100 ml

 

 

5 - Préparation du tampon phosphate 0,067 M pH 6,8

Hydrogénophosphate disodique (Na2 HP04, 12H20) 72 g

Eau distillée ................................................................................ 3000 ml

Hydrogénophosphate monopotassique

(KH2PO4 anhydre) .................................................................... 27,21 g

Eau distillée ................................................................................. 3000 ml

Mélanger à volumes égaux.

Vérifier le pH.

Stériliser 10 mn à 120°C.

Conserver à +4°C pendant 1 semaine.

 

Remarque générale

Il est recommandé d'utiliser pour toutes les préparations (tampons, solutions décontaminantes) de l'eau qui aura préalablement subi une filtration stérilisante sur membrane.